Наиболее важным условием успешного проведения анализа методом хроматографии -на бумаге является правильный выбор растворителя. Однако в настоящее время мы практически не располагаем критериями количественной опенки растворителей. Это создает затруднения при выборе растворителя из десятков и сотен публикуемых вариантов, а также лишает возможности сравнивать хроматографическое поведение различных веществ, пересчитывать Rf при перехода от одного варианта к другого и т.д.
По нашему мнению, рациональным способом устранения этих затруднений явилось бы применение в практике количественных характеристик наиболее употребительных систем растворителей. Подобные характеристики позволили бы систематизировать многочисленные рекомендованные на основе эмпирического подбора различными авторами варианты данной системы и без предварительного испытания давать им оценку, расчетным путем определять оптимальное количественное соотношение компонентов растворителя в связи с теми или иными цепями исследования, а также дали бы возможность легкого перехода от Rf- веществ в одном варианте к Rf - в другом в пределах данной системы , наконец, более полного использования систем.
На основе имеющегося литературного материала и полученных экспериментальных данных мы попытаемся охарактеризовать в общих чертах наиболее часто применяемые системы растворителей н-бутатол- уксусная кислота-вола и н-бутанол-муравьиная кислота-вода.
В хроматографическом процессе разделение на бумаге большинства веществ зависит от соотношения их растворимостей в водной неподвижной фазе и подвижной, образуемой органическими компонентами растворителя и остатком воды. Успешное разделение и получение качественных пятен хроматографируемых веществ гидрофильного характера (в том числе сахаров, органических кислот, аминокислот) достигается при условии весьма легкого образования водной неподвижно): фазы, что, в свою очередь, становится возможном в том случае, когда достаточное количество воды находится в растворителе в слабо связанном состоянии. Другими словами, качество хроматограммы возрастает при приближении к точке насыщения растворителя водой.
Двухфазные растворители неудобны в приготовлении и по дают точных сведений о соотношении компонентой в рабочей фазе. Кривые показывают процентное соотношение н-бутанола, воды и кислоты. При этом за 100% принимается расчетный суммарный объем растворителя без учета его изменения после смешения компонентов; проценты, таким образом, - объемные. Количество н-бутанола соответствует разности между 100 и суммарным процентным содержанием воды и кислоты. Приведенный способ расчета представляется практически удобным.
При построении кривой для уксусной кислоты был применен способ "титрования" уксусной кислотой смеси н-бутанола с водой до момента перехода эмульсии в однородную жидкость, то есть до перехода из двухфазного состояния в однофазное. Уксусная кислота при этом играет роль связывающего агента, увеличивая растворимость воды в растворителе. В качестве примера приведем несколько точек этой кривой:
% % вода — 16,7, уксусная кислота - О;
" - 21,5, уксусная кислота - 6,5;
“ - 25,0 ' " 9*4;
v - 32,0 ' ' - 12,6;
' - 40,0 ' " - 13,8.
Ишервуд и Джермин (1949) показали для ряда растворителей, что продвижение сахаров по бумаге, выраженное величиной , прямо пропорционально логарифму молярной доли воды в растворителе. Авторы исследовали подвижность сахаров в двухкомпонентных растворителях, насыщенных водой (одним из компонентов является спирт, эфир и т.п., другим - вода). Например, в системе н-бутанол-вода содержание воды составило 0,508 молярной доли, что отвечает точке на оси абсцисс с содержанием воды 16,7%, уксусной кислоты - 0%.
На основе этих данных можно было предположить, что существует также закономерная связь между составом растворителя, отвечающим остальным точкам выведенной кривой, и подвижностью сахаров.
Мы исходили из того, что в точках кривой растворитель находится в состоянии насыщения водой и, следовательно, вода, с одной стороны, одинаково легко доступна для образования комплекса целлюлоза - вода, то есть неподвижной фазы, а подвижная фаза, с другой стороны, обогащаясь водой (и соответственно уксусной кислотой), увеличивает подвижность хроматографируемых веществ. Полученные данные показали, что существует строгая зависимость между процентным содержанием воды в растворителе (и соответственно уксусной кислоты) и соотношением величин для сахаров. Было также найдено, что разделяющая способность растворителя закономерно уменьшается с увеличением в нем содержания воды-уксусной кислоты, однако скорость продвижения сахаров возрастает.
С увеличением содержания уксусной кислоты в растворителе при сохранении постоянства в процентном содержании воды при выходе за пределы кривой идет сужение "хроматографического спектра" и увеличение его подвижности. При этом наблюдается более сложная зависимость между содержанием в растворителе уксусной кислоты и соотношением значения RJ для сахаров. Кроме того, в рядах растворителей с различным процентным содержанием воды наблюдается различная зависимость между увеличением в них со держания уксусной кислоты и изменением соотношений величин RJ . Однако сокращение времени разгонки хроматограмм при увеличении процентного содержания в растворителе уксусной кислоты в ряде случаев целесообразно использовать в известных пределах. Например, если для разгонки сахаров, присутствующих в органах виноградной лозы, растворителем н-бутаиол-ук- сусная кислота-вода (4:1:5) требуется 60-70 часов, то. применяя растворитель с повышенным содержанием уксусной кислоты (например, года - 25%, уксусная кислота - 18-15%) можно получить хорошего качества хроматограмму за 40-44 часа. Поэтому область на графике, точки которой отвечают "работоспособным" составам растворителей, выделена над кривой для уксусной кислоты (штриховка).
Циммерман (1957), например, для разгонки в течение 15-24 часов олигосахаридной части "спектра" применил растворитель н-бутанол-уксусная кислота-вода 3:3:2 (или 25% воды,
37,5% уксусной кислоты). Однако при столь значительном содержании уксусной кислоты моно- и дисахариды разделяются плохо, качество хроматограммы остается весьма низким, особенно на "быстрых" сортах бумаги. В данном случае увеличение скорости разгонки идет в ущерб качеству. Тем не менее с целью экономии времени этот растворитель применяют и в работах последних лет при изучении обмена три— тетрасахаридов.
Из полученных данных видно, что наибольшая разделяющая способность растворителя проявляется при минимальном содержании в нем воды - уксусной кислоты, но при этом возрастает время разгонки. Например, для разделения галактозы - глюкозы следует употребить растворитель с содержанием воды 16,7-20%, уксусной кислоты - 0-4,7% или же- использовать растворитель, состав которого отвечал бы выделенной на графике области вблизи этого участка кривой. Если говорить об идентификации веществ по величинам Rf , следует пользоваться только составами, отвечающими точкам на кривой. В этих случаях пропорциональность между процентным содержанием воды-уксусной кислоты в растворителе и соотношением значений Rf для сахаров позволяет легко переходить от значений в одном составе к значению в другом.
Для определения "рабочей области" с муравьиной кислотой требовался иной методический подход. Муравьиная кислота, как кислота сильная, в смеси с н-бутанолом вызывает энергичный процесс этерификации, приводящий насыщенный водой растворитель к расслоению, то есть к переходу из однофазного в двухфазное состояние. Поэтому необходимо в момент приготовления растворителя применять такое количество воды, которое является недостаточным для его насыщения тем в большей степени, чем в большем количестве присутствует в растворителе муравьиная кислота (см. рис.).
Форма слабо связанной воды, активно участвующая в процессе хроматографического разделения веществ, в растворителях с большим содержанием муравьиной кислоты образуется уже во время использования их благодаря ряду факторов (появление бутил-формиата, понижающего гидрофильность растворителя, увеличение количества воды и уменьшение количества связывающего агента - муравьиной кислоты в результате реакции этерификации). Поэтому критерием при выведении кривой для муравьиной кислоты служил в наших опытах условный показатель - расслоение растворителя на хроматограмме (восходящий способ) через 40 часов с момента его приготовления. На графике вправо от кривой заштрихована область, точки ко - торой отвечают составам растворителя, расслаивающимся за более короткий промежуток времени, но позволяющим еще их практическое использование. Слева - "работоспособные" составы растворителей, которые расслаиваются через больший промежуток времени.
Кривая с муравьиной кислотой представляет прежде всего интерес для подбора оптимальных составов растворителей, пригодных для разгонки органических кислот, а также аминокислот (главным образом участка "спектра": цистин-аланин). В отношении органических кислот следует отметить то обстоятельство, что при увеличении в растворителе содержания муравьиной кислоты (верхний участок кривой) возрастает вытеснение анионов винной и щавелевой кислот из их труднорастворимых солей, что позволяет наносить на хроматограмму не очищенные от катионов вытяжки или клеточный сок из органов виноградной лозы.
При проявлении хроматограмм бромфенолсиним наряду с определением по желтым пятнам анионов кислот можно одновременно идентифицировать по темно-синим пятнам катионы кальция, магния, калия. При этом кальций и калий разделяются достаточно хорошо, но кальций и магний - плохо.
Рис.6. Рабочие области систем:-бутинол-уксусная кислота-вода и н-бутинол-муравьиная кислота-вода: а-б-в - для уксусной кислоты; а-б-г - для муравьиной кислоты.
При использовании для разгонки неочищенных вытяжек или клеточного сока растворителей, состав которых отвечает нижнему участку кривой (при содержании муравьиной кислоты в растворителе 4-13%), анион винной кислоты расположится выше всех упомянутых катионов. При этом винная кислота проявится в виде растянутого пятна, поскольку в этих составах растворителей вытеснение аниона из кальциевой и кислой калиевой солей винной кислоты происходит не полностью и вяло, количественного учета ее в этих случаях добиться нельзя.
Однофазные растворители данной системы, используемые при анализе органических кислот в вине и винограде, отвечают, как правило, нижнему участку кривой. Например, растворители, рекомендуемые Родопуло (1956,1960), н-бутанол-муравьиная кислота-вода 70:10:20 и насыщенный водой н-бутанол-муравьиная кислота 95:5 соответствуют. учитывая, что обычно при. меняется 85-процентная муравьиная кислота, следующим точкам на графике: 21,5% воды - 8,5% кислоты и 16,6% воды - 4,2% кислоты. Попов и Чистякова (1960) использовали растворитель состава 80:3:15 ( или 15,7% воды - 4,2% муравьиной кислоты).
При увеличении кислотности растворителя добавлением в него муравьиной кислоты до 20-25% достигается существенное улучшение разгонки начальной части "спектра"’. (Например, 23% муравьиной кислоты - 6,5% воды). В этом случае расположение пятен будет следующим (от старта): кальций, магний, винная кислота, калий, лимонная кислота, яблочная и т.д. Винная кислота в этих растворителях вытесняется из солей более полно.
Нужно отметить, что кальций дает несколько пятен по числу анионов, с которыми он образует труднорастворимые соли (щавелевой, винной кислот).
Рекомендуемые составы растворителей с высоким содержанием муравьиной кислоты в ряде случаев могут иметь безусловные преимущества, прежде всего при выяснении солевого состава анализируемого материала. При пользовании этими растворителями можно обойтись без очистки вытяжки (клеточного сока) ионообменными смолами или другими существующими способами.
Как правило, клеточный сок, полученный из убитых горячим паром вегетативных органов виноградной лозы, содержит осадок кальциевых солей винной, щавелевой кислот, кислой калиевой соли винной кислоты. Перед нанесением на хроматограмму в этих случаях к соку следует добавлять равный объем 50-процентной муравьиной кислоты.
Муравьиная кислота хорошо растворяет осадок, что позволяет избежать при нанесении его на хроматограмму появления пятен анионов посторонних кислот.
При анализе аминокислот разделяющая способность растворителя с муравьиной кислотой при увеличении ее содержания и, следовательно, уменьшении содержания воды возрастает. Практически целесообразно использовать растворитель с муравьиной кислотой для разгонки участка 'спектра': цистин-аланин. Однако следует отметить, что при увеличении содержания муравьиной кислоты свыше 15% разрушение гистидина и других щелочных аминокислот становится резко выраженным. Поэтому, очевидно, для разгонки аминокислот следует остановиться на составах 13-15% муравьиной кислоты. Широко применяемый при анализе аминокислот состав растворителя 75:15:10 лежит в этой области.
Касаясь методов проявления хроматограмм, следует упомянуть о хорошо зарекомендовавшем себя проявителе сахаров на основе этилового эфира н—аминобензойной кислоты (анестезин), предложенном сотрудником института "Магарач" Н.В. Помазковым. Анестесин выгодно отличается чистотой реактива и безвредностью, приближаясь по типу проявления к анилину. Хроматограмма протягивается через проявитель (2,0 г анестезина и 2,0 г фталевой кислоты в 100 мл ацетона), обсушивается и проявляется при 120-140 С.
При анализе органических кислот автор статьи рекомендует совмещать разгонку хроматограмм с обработкой их проявителем. Для этого на 100 мл растворителя нужно добавить 60-70 мг бромфенол-синего. Для проявления разогнанной хроматограммы ее достаточно высушить в токе воздуха комнатной температуры. Для более контрастного проявления катионов готовую хроматограмму следует нагреть до 100-120 С.
Таким образом, предлагается способ анализа систем растворителей и приводится краткая характеристика систем н-бутанол-уксусная кислота-вода и н-бутанол-муравьиная кислота-вода. Подобные характеристики позволяют полнее использовать возможности каждой из систем растворителей. Вместе с тем все многообразие составов, различающихся по количественному соотношению компонентов, сводится в систему с общим знаменателем в виде кривой, отвечающей точкам насыщения растворителя водой и позволяющей делать переход от значений веществ в одном составе к значениям /?/ в другом или же по значениям определять неизвестный заранее состав растворителя данной системы. Количественная характеристика дается в статье для системы с уксусной кислотой.
