Главная >> Статьи >> Книги >> Методики по физиолого-биохимическим исследованиям >> Количественное цитохимическое определение крахмала

Количественное цитохимическое определение крахмала

Определение крахмала в растительном материале обычными методами биохимического анализа, несмотря на их формальную точность, не всегда дает достаточно удовлетворительные результаты. Во многих случаях более точными в биологическом смысле являются показатели содержания крахмала, полученные путем цитохимического определения на срезах тканей под микроскопом. В основе определения лежат общие принципы микрохимии растений (Л.И.Джапаридзе, 1953)
Определения можно проводить как на свежем, так и на консервированном материале. Однако способ хранения и обработки материала должен быть одинаковым для всех сравниваемых образцов, так как он может оказать влияние на состояние крахмальных зерен и восприимчивость их к реактивам. Для консервирования образцов древесины виноградного растения удовлетворительной средой является смесь равных частей этилового спирта, глицерина и воды с прибавлением одного процента формалина. Входящий в состав смеси глицерин способствует некоторому размягчению одревесневшего материала и облегчает его резку.
Срезы, выполняемые на микротоме или от руки, должны иметь строго определенную толщину, поскольку с ее изменением при одном и том же содержание крахмала в клетках изменяются оптическая плотность и насыщенность окраски препарата.

Цитохимическое определение крахмала в материале, не залитом в парафин или иную среду, необходимо вести на срезах, включающих один слой (ярус) неповрежденных клеток. В противном случае крахмал в процессе резки и обработки препаратов теряется и данные учета оказываются заниженными.
При просмотре очень толстых срезов, включающих несколько слоев клеток, степень заполнения их крахмалом будет казаться большей, чем она есть в действительности ( вследствие оптического наложения друг на друга клеток, находящихся на разных уровнях ).
На поперечных срезах крахмал особенно легко теряется при повреждении клеток лучевой паренхимы. Если учесть, что поперечник их в древесине различных органов винограда равен 20-25 мк, то для цитохимического исследования следует брать срезы толщиной около 30 мк. При изучении осевых органов в большинстве случаев можно ограничиться определениями на поперечных срезах, однако для контроля следует использовать также продольные тангентальные срезы толщиной около 30 мк.
В качестве реактива при цитохимическом определении крахмала применяют 0,2-пропентный раствор йода с йодистым калием, для приготовления которого 1 г К йод растворяют при нагревании в 5 мл дистиллированной воды, после чего в этот же раствор добавляют 1 г кристаллического йода. Полученный раствор разбавляют до 500 мл и хранят в темноте в склянке с хорошо притертой пробкой. При обработке различных препаратов следует пользоваться раствором одинаковой концентрации. Порча раствора, связанная с выделением йода, требует его периодической замены свежеприготовленным раствором.

Срезы споласкивают в дистиллированной воде, помещают на 1 минуту в 1-процентный раствор НСl ,затем переносят мягкой кистью на часовые стекла или в неглубокие стаканчики и. покрывают пятью-шестью каплями раствора. Для массовой работы весьма удобны многогнездовые кюветы, которые можно изготовить из чашек Петри. Срезы выдерживают в растворе 10-15 минут, наблюдая за тем, чтобы они были полностью покрыты жидкостью. Через некоторое время крахмальные зерна приобретают фиолетовую окраску раз - личной интенсивности. После этого срезы переносят на предметное стекло в каплю глицерина, покрывают покровным, стеклом и исследуют под микроскопом. Исследование проводят при верхнем положении конденсора микроскопа и достаточно высокой интенсивности освещения. Слабое и переменной силы освещение приводит к ошибкам в определении. Поэтому необходимо пользоваться осветителем ОИ-7 (с синим светофильтром) или осветителями, входящими в комплект биологических микроскопов.
Для цитохимического определения крахмала в тканях органов винограда можно пользоваться микроскопом с увеличениями от 7x8 до 7x40.
Принцип количественного учета при цитохимическом определении крахмала основан на глазомерной оценке степени заполнения крахмалом полостей клеток по десятибалльной шкале и подсчете числа клеток, содержащих крахмал, по отношению к общему числу их в поле зрения микроскопа. Суммарный итог выражают в процентах. Приводим конкретный пример соответствующего расчета. В поле зрения микроскопа на срезе виноградного побега 25 клеток лучевой паренхимы. Пять из них не содержат крахмала, у двух клеток крахмальные зерна заполняют 2/10 клеточной полости, у десяти - 5/10 и у восьми - 8/10. Суммарное заполнение полостей клеток крахмалом составляет:

Учет содержания крахмала следует проводить раздельно для разных тканей или структурных элементов исследуемого органа.
Осевые органы виноградного растения включают следующие крахмалсодержащие ткани и структурные элементы: в древесине - лучевая паренхима, либриформ, древесная паренхима, обкладочные клетки, перимедуллярная зона; в коре - лубяная паренхима, твердый луб, феллодерма, а также клетки, примыкающие к перицикловым волокнам (в первичной коре). Доля каждого из этих элементов по отношению к общему объему тканей зависит от принадлежности их к тому или иному органу, от его состояния, собственного и общего возраста органов и т.д.
Относительный объем отдельных структурных элементов, способных к накоплению крахмала, может быть найден путем микрометрических измерений на анатомических срезах органа. На основе такого определения 'с учетом фактического содержания крахмала могут быть получены средневзвешенные показатели количества его в клетках органов и частей виноградного растения.
Важными показателями, характеризующими биохимические свойства крахмала, являются диаметр его зерен, интенсивность окраски и быстрота потери ее после окончания воздействия красителя. Эти свойства необходимо по возможности учитывать в ходе цитохимических определений крахмала.
В наших исследованиях количественное цитохимическое определение крахмала в многолетних частях виноградных кустов позволило выявить картину его локализации по тканям разного возраста, динамику его изменений на протяжении годичного цикла развития растений и влияние старения тканей на интенсивность крахмального обмена.
При тщательном проведении работы количественное патохимическое определение крахмала позволяет получить данные, мало отличающиеся от показателей, харастеризующих динамику абсолютного количества крахмала, приходящегося на одну клетку виноградного побега (рис. ).


Динамика содержания крахмала в побегах винограда: 1 - в процентах к сухому веществу; 2 - вес, приходящийся на одну клетку; 3 - процент заполнения полостей клеток по данным цитохимического определения.

 
< Определение состава сахаров в почках и побегах методом хроматографии   Колориметрический метод определения пектиновых веществ >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх