Главная >> Статьи >> Книги >> Методики по физиолого-биохимическим исследованиям >> Количественное определение кетоолигосахаридов методом хроматографии

Количественное определение кетоолигосахаридов методом хроматографии

Известно, что подготовка и зимовка виноградной лозы находятся во взаимосвязи со степенью гидролиза крахмала и накоплением сахаров.
В последнее время во многих работах при изучении вопросов зимостойкости и морозостойкости виноградной лозы обращают внимание на олигосахариды, в частности рафинозу и стахиозу. Эти сахара появляются в конце лета, содержание их увеличивается зимой и в начале вегетации они исчезают. Их даже называют "зимними сахарами".
Рафиноза и стахиоза находятся в микроколичествах в сопровождении других сахаров и обычными химическими методами определению не поддаются. Поэтому при изучении морозостойкости виноградной лозы Мы использовали метод количественного определения рафинозы в побегах виноградной лозы, который включает хроматографию на бумаге и последующее количественное определение прямо на проявленной бумаге с учетом площади и интенсивности окраски пятен при помощи фотоэлектрического денситографа, позволяющего быстро регистрировать проявленные вещества.
Расчет производится по выведенной калибровочной кривой с поправкой на каждое определение. Ошибка метода + 9,2%. Брали средние арифметические данные из четырех повторных определений.
Определение проводили следующим образом.
Фиксированный паром измельченный материал побегов (2 г) экстрагировали 30 мл 70-процентного этилового спирта- 3 раза при комнатной температуре (один раз оставляли на ночь, в дальнейшем - по 2 часа). Объединенные спиртовые экстракты очищали 10- процентным уксуснокислым свинцом и затем на ионообменной колонке с катионитом КУ-1. Количественно промытый раствор сгущали на автоматической водяной бане при 45-50 С. Хорошее разделение можно получить, если не пропускать через ионообменную колонку, сохраняя указанный ниже режим разгонки хроматограммы.
Сухой остаток растворяли в 2-4 мл 10-процентного изопропилового спирта и центрифугировали, затем наносили на хроматографическую бумагу Ленинградская 2 из расчета 25 мг сухого вещества в одном пятне. Бумагу предварительно разрезали на полосы в соответствии с размерами кассеты денситографа (рнс.1). Разделение сахаров проводили в смеси н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5) в нисходящем потоке при семикратном пропускании растворителя (один раз - 48 часов, потом по 24 часа). При таком режиме быстро передвигающиеся сахара вымываются из бумаги, а олигосахариды с низким достаточно хорошо разгоняются. Проявляли, погружая хроматограммы в ацетоновый раствор мочевины (1 г мочевины, 10 мл 0,1 н,соляной кислоты и 90 мл ацетона) ~ специфический и очень чувствительный проявитель для кетосахаров. Фон бумаги оставался совершенно чистым, что очень важно при светопропускании и совпадении данных повторных определений. Проявление кетоолигосахаридов проводили в сушильном шкафу при строго определенных условиях (5 минут при 105 С). Интенсивность окраски проявляемых сахаров во многом за - висит от стандартизации режима проявления. Специально проведенные опыты со стандартным раствором рафинозы показали, что малейшее нарушение режима проявления (температуры и времени) приводит к невоспроизводимости параллельных определений, поэтому особенно важным моментом при определении олигосахаридов является проявление. Проявленную полоску, прежде чем вставить в кассету денситографа, парафинировали, после чего проводили автоматическую запись светопропу- скаемости.

Рис.1. Шаблон для хроматограмм.

Рис. 2. Калибровочная кривая рафинозы.

Далее соответствующие участки бумаги, очерченные кривой, вырезали и взвешивали на аналитических весах. При помощи специально выведенной кривой вес бумаги пересчитывали на
площадь. Для перехода к концентрации вещества пользовались стандартной кривой для рафинозы (рис.2). Этим методом можно определить также количество стахиозы и других кетоолигосахаридов после составления соответствующих кривых.
Чтобы проверить, не происходит ли потеря некоторого количества рафинозы при хроматографировании, мы провели ряд опытов с чистыми растворами рафинозы непосредственно сразу после нанесения на бумагу, а также после стекания растворителя. Опыты показали, что хорошие результаты получаются в диапазоне 100-400  рафинозы в пятне, так как потери при этом несущественны.
Цель наших исследований - установить поведение кетоолигосахаридов у морозостойкого и неморозостойкого сортов винограда в период покоя, а также при искусственном промораживании побегов и во время оттепелей.
Проведенные анализы показали, что количество рафинозы колеблется в пределах 0,43-1,35%, а стахиозы. - 0,18-0,84% в зависимости от сорта и времени анализа. Эти олигосахариды так же динамичны, как и другие сахара. С похолоданием их количество возрастает, сильно уменьшаясь к весне, и в последующем рафиноза и стахиоза исчезают.
Проявление олигосахаридов у зимующих растений в период покоя является общебиологическим явлением на разных географических широтах. Установлено, что причиной их появления является встреча растения с холодом. Сергеевым и другими (1961) установлено, что в условиях Урала морозостойкие породы отличаются от неморозостойких большим содержанием олигосахаридов и более разнообразным их набором. Яблонский (1962) для условий Крыма не установил прямой зависимости между содержанием рафинозы и степенью морозостойкости яблони. В литературе имеются разноречивые данные о роли олигосахаридов. Экспериментальными работами Акира Сакаи (1962) доказано, что защитную роль сахаров можно представить в следующем убывающем порядке.
Ксилоза, рамноза  > глюкоза, фруктоза, галактоза > сорбит, сахароза, лактоза > рафиноза, маннит.
Отсюда видно, что рафиноза по сравнению с остальными перечисленными веществами обладает наименьшей защитной функцией. Следовательно, роль рафинозы в свойстве морозостойкости нельзя понимать в прямом
смысле.
По нашим данным, у зимостойкого сорта (рис.3) при промораживании побегов кривая содержания рафинозы практически не меняется, тогда как у неморозостойкого сорта подвергается резким количественным изменениям. Различия отмечаются в характере кривых содержания рафинозы и в естественных условиях (рисА ).

Рис.3. Поведение рафинозы у различных сортов.

Чередование морозов и оттепелей во второй половине января привело к снижению количества рафинозы у неморозостойкого сорта, тогда как в этих же условиях у морозостойкого сорта оно неуклонно возрастало и достигло своего максимума. То же отмечалось и в поведении стахиозы, только в меньших амплитудах изменения. Потепление к вес - не привело к снижению, причем, у морозостойкого сорта более замедленным темпом, чем это наблюдалось у неморозостойкого сорта. Поэтому при сильном похолодании первого марта (-17 ) содержание рафинозы у морозостойкого сорта оказалось более высоким, чем у неморозостойкого. Иначе говоря, морозостойкий сорт не поддается провоцирующему действию оттепелей. Кривая этого сорта имеет свой определенный характер, который не меняется также при искусственном промораживании побегов. Следовательно, для морозостойкого сорта характерным является наименьшее колебание рафинозы при воздействии оттепелей и морозов.

Рис.4. Динамика олигосахаридов в побегах в условиях открытой зимовки.
Резюмируя, следует указать, что описанный метод определения кетоолигосахаридов доступен, дает хорошо воспроизводимые данные прямо на хроматографической бумаге без манипуляций с элюцией. Его можно применять и при изучении других плодовых культур
Исследования, проведенные по этому методу, показали, что для морозостойкого сорта характерным при смене оттепелей и похолодания является наименьшее колебание количества олигосахаридов. Максимум их достигается в период наиболее высокой устойчивости сорта. У неморозостойкого сорта чередование оттепелей и морозов нарушает закономерное возрастание количества олигосахаридов. Поэтому максимум рафинозы и стахиозы здесь наблюдается не при высокой устойчивости сорта.

 
< К использованию метода Аблова-Батыра для определения восстанавливающих сахаров   Определение состава сахаров в почках и побегах методом хроматографии >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх