Пластидные пигменты зеленых растений представляют собой ту часть фотосинтетического аппарата, которая непосредственно связана с осуществлением процесса фотосинтеза. Поэтому для глубокого познания этого процесса большое значение имеют вопросы качественного и количественного соотношения пигментов.
Одна из разновидностей метода хроматографии - хроматография на бумаге является незаменимым средством при изучении фотосинтетических пигментов, их качественного и количественного разделения и определения.
Исследование пигментов пластид с помощью бумажной хроматографии включает в себя следующие этапы работы:
а) взятие средней пробы и фиксация материала;
б) извлечение пигментов растворителями и нанесение их на хроматографическую бумагу;
в) разделение пигментов на хроматограмме;
г) элюция пигментов, определение их концентрации и расчет содержания пигментов.
Взятие средней пробы материала. При отборе средней пробы необходимо иметь в виду, что содержание пигментов и их соотношение заметно варьирует в зависимости от ряда внешних факторов и внутренних условий. Поэтому для отбора средней пробы нужно брать такое количество материала, чтобы можно было получить достоверные результаты. При отборе проб имеет значение, в каком виде поступает мате, риал на анализ (в свежем или сухом). Материал из свежих листьев отбирают в количестве 2-3 г (обычно из листьев вырезают диски пробочным сверлом определенного диаметра). Большие навески свежего растительного материала содержат большое количество воды, поэтому при извлечении пигментов необходимо при. менять более концентрированный растворитель (ацетон 90-100%). Свежий материал следует фиксировать с цепью инактивации ферментов. Фиксацию при высоких температурах (90—100 С) лучше всего проводить в фосфатном буфере при pH 7-10, который применяется для нейтрализации кислот клеточного сока. Наилучшим способом инактивации ферментов является фиксация при отрицательных температурах (минус 35 - минус 70 ), которая достигается с помощью охладительных смесей.
Извлечение пигментов растворителями и нанесение их на хроматографическую бумагу. Для полного извлечения пигментов материал измельчают в фарфоровой ступке с кварцевым песком или в гомогенизаторе. Если материал не был предварительно фиксирован в фосфатном буфере, то при растирании добавляют к нему небольшое количество (на кончике ножа) мела, соды или углекислого магния. Пигменты извлекают из растертого материала органическими растворителями (спирт, ацетон, петролейный эфир, бензин). Чаще всего для извлечения пигментов пластид применяют смесь этилового спирта с ацетоном в отношении 3:1, возможны и другие соотношения этих растворителей, а также чистого спирта и ацетона. После тщательного растирания материала в ступке вытяжку фильтруют через стеклянный фильтр № 2 в колбу. Осадок на фильтре промывают той же смесью спирта и ацетона два - три раза. Объем вытяжки доводят в мерной колбе до 20—25 мл
На бумагу можно наносить пигменты, находящиеся в любом органическом растворителе, а также в любой их смеси. Это объясняется тем, что органические растворители при подсушивании хроматограмм в токе воздуха испаряются. Способ нанесения на бумагу зависит от выбора хроматограммы.
Более полное разделение пигментов происходит в двумерных хроматограммах с применением нескольких растворителей. Однако при этом можно разделить только малые их количества, так как исходную смесь наносят в виде небольшого пятна. Для количественных определений лучше применять одномерные хроматограммы, так как в этом случае вытяжку наносят в виде полоски на одном конце бумаги. Стартовую полоску наносят возможно равномерней, чем достигается более тщательное разделение пигментов. Нижний край стартовой полоски должен отстоять от нижнего края бумаги не менее чем на 2-3 см и не доходить до боковых краев бумаги на 0,5-4 см. Объем наносимого раствора зависит от его концентрации, от размера листов бумаги, употребляемой для хроматографии. Бумагу укрепляют таким образом, чтобы нижний край был свободен. Придерживая бумагу за угол, раствор наносят пипеткой.
Разделение аугментов на хромотограмме (по методу Сапожникова Д.И. и др., 1955). На хроматографическую бумагу размером 16x16 см на расстояний 2 см от края наносят пипеткой несколько капель вытяжки с одновременным их подсушиванием, пока не образуется яркое зеленое пятно. Затем бумагу, свернутую в трубку, помещают на дно цилиндрического стеклянного сосуда с притертой крышкой, в который предварительно наливают растворитель слоем 0,5 см (смесь бензола и петролейного эфира в отношении 3:1). Когда растворитель достигнет почти верха бумаги, хроматограмму вынимают и высушивают в токе воздуха. На хроматограмме выше всех пигментов располагается каротин, ниже ксантофилл и еще ниже частично разделенные хлорофиллы 'а" и 'б'.
Для отчетливого разделения хлорофиллов хроматограмму свертывают в направлении перпендикулярно первому и опять, помещают в цилиндрический сосуд. В качестве растворителя берут смесь этилового спирта с петролейным эфиром в отношении 1:14. При этом происходит полное разделение хлорофиллов. Выше размещен хлорофилл "а", ниже - 'б'. Для количественного определения пигментов вырезают каждое пятно и растворяют в соответствующем растворителе.
Разделение пигментов на одномерной хроматограмме. Для разделения пигментов калибровочной пипеткой наносят на одну сторону листа хроматографической бумаги строго отмеренное количество ацетонового экстракта пигментов. Размер листа бумаги зависит от употребляемых для хроматографии стеклянных сосудов. Экстракт наносят пипеткой в виде узкой полоски на расстоянии 2 см от края. После высушивания в токе воздуха на полоску наносят еще несколько раз вытяжку пигментов, пока не образуется ярко-зеленая полоска. После этого бумагу опускают в цилиндр с растворителями (смесь бензола и петролейного эфира в соотношении 3:1). На хроматограмме каротин и ксантофилл четко отделяются один от другого и от хлорофиллов, а последние разделяются неполностью. Для количественного определения пигментов такого разделения вполне достаточно, если производить на спектрофотометре, где концентрацию хлорофиллов 'а' и 'б' можно определить в растворе отдельно. Если же требуется разделить хлорофиллы, то для этого пользуются одномерной хроматограммой для разделения зеленых пигментов.
Хлорофиллы 'а' и 'б ' легко разделяются на бумаге в смеси петролейного эфира и спирта в отношении от 20: 1 до 14:1. Величину устанавливают в зависимости от соотношения компонентов, количества пигментов, нанесенных на хроматограмму. На хроматограмме хлорофилл 'а' размешается ближе к верху, а хлорофилл 'б'- ближе к стартовому пятну.
Длительность хроматографирования должна быть достаточной для полного отделения пигментов одного от другого. Однако, чтобы полоски не расплылись, не следует сильно увеличивать время хроматографирования. За ходом процесса необходимо строго следить и не допускать подсыхания верхней части хроматограммы, так как это приводит к сдвигу отдельных пигментных полос.
Элюция пигментов с бумаги. После разделения пигментов хроматограмму вынимают из сосуда и дают испариться растворителю. Затем разрезают ее на полоски в соответствии с положением отдельных пигментов. Каждую полоску разрезают на маленькие кусочки и помещают в небольшие химические стаканчики. Пигменты элюируются смесью спирта с ацетоном в отношении 3:1. Для лучшей элюции пигментов бумажки предварительно смачивают несколькими каплями этилового спирта. Пигмент с бумажек смывают несколькими порциями смеси спирта и ацетона при осторожном помешивании стеклянной папочкой. Отдельные порции смеси растворителей сливают через воронку в мерную колбу и доводят до определенного объема - от 5 до 25 мл. Объем элюата должен быть таким, чтобы концентрация пигментов была достаточной для определения его с помощью оптических приборов.
Количественно пигменты определяют при помощи концентрационного колориметра, фотоэлектроколориметра и наиболее точно - спектрофотометра. Полученные данные Позволяют рассчитать концентрацию пигментов без калибровочных кривых, на основании экспериментов по оптической плотности и известных для каждого пигмента величин молярного или удельного коэффициента погашения при известной длине волны.
В практике для массовых определений пигментов широко используется фотоэлектроколориметр, с меньшим успехом - концентрационные колориметры Кол-1.
