Выяснению механизма образования 2-фенилэтанола уделяли большое внимание многие исследователи (Η. М. Сисакян, Г. Тукис, Б. К. Ранкин и др.). Эрлих (1911, 1912 гг., цитировано по П. Бидану, 1975) предложил схему образования 2-фенилэтанола из фенилаланина, а также схему образования других высших спиртов из аминокислот приводит убедительные данные, показывающие, что значительная часть 2-фенилэтанола образуется дрожжами из сахаров.
Синтез фенилаланина и тирозина, как установил Б. Мандль и др. (1973), связан с образованием 2-фенил- этанола и тирозола. При многократной фильтрации бродящего сусла и последующих забраживаний в вине накапливается значительное количество 2-фенилэтанола (Шольц, 1974; Мандль и др., 1973).
А. Харвалиа (1976) установил, что при сбраживании виноградного сока количество образовавшегося 2-фенилэтанола прямо пропорционально количеству сброженного сахара.
Противоречивые сведения о влиянии 2-фенилаланина на образование 2-фенилэтилового спирта предполагают дальнейшее исследование его образования в винах. Хотя и установлено, что при биологическом азотопонижении в винах накапливается повышенное количество 2-фенилэтанола, однако отсутствуют доказательства связи между этими процессами. Изученные факторы, влияющие на образование 2-фенилэтанола, не позволяют объяснить его высокое содержание в некоторых винах. Отсутствуют рекомендации по способам значительного повышения содержания 2-фенилэтанола в винах. Известно, что в шампанских виноматериалах содержание 2-фенилэтанола не должно превышать 25 мг/л (Родопуло, 1975), однако нет рекомендации по регулированию его содержания при брожении независимо от исходного содержания фенилаланина в сусле.
Установлено (Кроуэлл и др., 1963), что в присутствии суспендированных частиц при быстром брожении образуется меньше высших спиртов. Аналогичные результаты получены А. Заморани и др. (1973) при сбраживании сусла в присутствии бентонита. С целью исследования возможности регулирования содержания 2-фенилэтанола в винах представляется важным установление влияния ускорителей брожения на его образование. Известно, что бентонит (Яцына и др., 1968) и тиамин (Лафон-Лафуркад, 1967) ускоряют брожение.
Наши опыты по брожению сусла с добавлением бентонита в количестве от 0,3 до 4 г/дал показали, что в вине накапливается в среднем на 54% больше 2-фенилэтанола, а содержание высших алифатических спиртов снижается на 7—23% по сравнению с контролем. Внесение в сусло и перед брожением тиамина в количестве от 1 до 20 мг/л приводит к увеличению содержания 2-фенилэтанола по сравнению с контрольным образцом на 9—40%. Накопление 2-фенилэтанола из фенилаланина нельзя объяснить его повышенным образованием по схеме Эрлиха (цитировано по П. Бидану, 1975).
Фенилаланин был потреблен полностью как в опытном, так и в контрольном образцах. Можно предположить, что повышение количества 2-феиилэтанола, образующегося при ускорении брожения неорганическими и биологическими активаторами, происходит по схеме Т. Аирапаа (1965) из сахаров.
Повышенное накопление 2-фенилэтанола при быстром брожении, возможно, обусловлено количеством образовавшейся биомассы дрожжей (Фланзи и др., 1965).
Таблица 25
Влияние биомассы дрожжей на образование 2-фенилэтанола
Влияние биомассы дрожжей на образование высших алифатических спиртов при брожении пивного сусла исследовано в достаточной степени (Грачева и др., 1971). С целью изучения влияния биомассы дрожжей на образование 2-фенилэтанола нами проведены опыты по брожению сусла с подавлением функции размножения дрожжей. В виноградное сусло вводили перед брожением дрожжи расы Судак VI-5 в количестве 1, 2 и 8 г/л. С увеличением количества введенных дрожжей функция их размножения, как и следовало ожидать, уменьшается (табл. 25). Введение перед брожением 2 и 8 г/л дрожжей приводит к уменьшению прироста биомассы дрожжей соответственно па 5 и 35%. Количество образовавшегося 2-фенилэтанола уменьшается также на 22 и 12%. Следовательно, определенное количество 2-фенил- этанола образуется как побочный продукт при размножении дрожжей независимо от количества сброженных сахаров и содержания фенилаланина в сусле. Содержание высших алифатических спиртов при увеличении дозы введения дрожжей возрастает. Это свидетельствует о возможном отличии механизмов образования 2-фенилэтанола и высших алифатических спиртов.
Л. Усселио-Томассе (1967) считает, что образование 2-фенилэтанола при брожении виноградного сусла можно интерпретировать как определенный этап при эндоклеточном синтезе фенилаланина дрожжами. Очень важно установить новые доказательства возможного участия
2-фенилэтанола в эндоклеточном синтезе фенилаланина. Связанный с этим вопрос о возможности регулирования содержания 2-фенилэтанола в винах может быть использован при разработке технологических схем производства некоторых типов вин.
С целью исследования этого вопроса сусло сорта Рислинг рейнский сбраживали при температуре 20°С с использованием дрожжей расы Судак VI-5 в сосудах вместимостью 1 л. После сбраживания 45% сахара и исчезновения фенилаланина из субстрата в бродящее сусло вводили 2-фенилэтанол в количестве 50 мг/л и 100 мг/л. Параллельно сбраживали сусло без введения 2-фенилэтанола в качестве контроля. Содержание высших спиртов и аминокислот определяли в исходном сусле после сбраживания 45% сахара и в сброженном сусле. Результаты определений приведены в таблице 26. Введение 2-фенилэтанола после сбраживания 45% сахара на образование высших алифатических спиртов заметного влияния не оказывает. В опытных образцах наблюдается более интенсивное снижение содержания аминокислот: на 2,6% больше при введении 50 мг/л 2-фенилэтанола и на 16,7% больше при введении 100 мг/л 2-фенилэтанола.
Снижение содержания аминокислот происходит в основном за счет пролина.
Введение 100 мг/л 2-фенилэтанола в сусло, лишенное фенилаланина, в середине брожения приводит к появлению в сброженном сусле 2,35 мг/л фенилаланина. В остальных опытных образцах фенилаланин присутствует лишь в следах. Появление фенилаланина в среде, относительно богатой 2-фенилэтаиолом, позволяет предположить, что 2-фенилэтанол является промежуточным продуктом при синтезе дрожжами фенилаланина из сахаров.
Можно ожидать, что выделенный в среду дрожжами фенилаланин при наличии благоприятных условий для жизнедеятельности и размножения дрожжевых клеток будет усваиваться ими с выделением 2-фенилэтанола по схеме Эрлиха. В связи с этим можно предположить, что повышенное содержание 2-фенилэтанола в бродящем сусле, лишенном фенилаланина, способствует образованию дрожжевыми клетками из сахаров через фенилаланин новых количеств 2-фенилэтанола.
Таблица 26
Влияние 2-фенилэтанола на потребление аминокислот при брожении виноградного сусла (мг/л)
Таблица 27
Влияние 2-фенилэтанола на образование высших спиртов и потребление аминокислот при брожении виноградного сусла
С целью выяснения этого вопроса нами было сброжено пастеризованное виноградное сусло с добавлением перед брожением 25 мг/л 2-фенилэтанола и без него. В опытном и контрольном образцах определяли содержание высших спиртов и аминокислот перед брожением, после сбраживания 45% сахаров и в конце брожения. Результаты определений приведены в таблице 27. В образце с добавлением 2-фенилэтанола во второй половине брожения его накапливается примерно в 2 раза больше (табл. 28), отмечено также повышенное накопление изоамилола.
Таблица 28
Влияние 2-фенилэтанола на образование высших спиртов в различные периоды брожения
Таблица 29
Влияние 2-фенилэтанола, введенного в свежеотжатое виноградное сусло, на образование 2 фенилэтанола в виноматериале
Снижение содержания аминокислот в опытном образце в течение всего периода брожения на 39% больше, чем в контрольном. Более интенсивное уменьшение содержания аминокислот происходит в опытном образце в основном за счет пролина во второй половине брожения и за счет фенилаланина в течение всего процесса.
Несмотря на более интенсивное образование во второй половине брожения 2-фенилэтанола в образце, где он введен перед брожением, его прирост за весь период
процесса незначительный и составляет 2,2 мг/л. Введение 50 и 400 мг/д 2-фенилэтанола перед брожением в пастеризованное виноградное сусло не вызывает его прироста.
Нами проведены такие опыты и в сезон виноделия со свежеотжатым отстоенным виноградным суслом (табл. 29). Введение перед брожением 2-фенилэтанола в количестве 50 мг/л приводит к приросту его содержания на 87,51 мг/л, или на 38,3% больше, чем в контрольном образце. Введение 400 мг/л 2-фенилэтанола не вызывает увеличения его содержания.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что образование 2-фенилэтанола зависит не только от содержания фенилаланина, но и в большей степени от содержания самого 2-фенилэтанола в исходном виноградном сусле. Можно предположить, что высокое накопление 2-фенилэтанола в мускатных винах (Шольц, 1974) в определенной степени объясняется большим содержанием его в сусле винограда Мускат белый.
Проведенные нами эксперименты дают возможность объяснить схему образования 2-фенилэтанола при брожении сусла, где он содержится в значительных количествах. Содержание 2-фенилэтанола в вине, очевидно, складывается следующим образом: 1) образование по схеме Эрлиха из фенилаланина, содержащегося в исходном сусле; 2) образование по схеме Аирапаа из сахаров; 3) образование по схеме Эрлиха из фенилаланина, образовавшегося из 2-фенилэтанола; 4) 2-фенилэтанол, перешедший из виноградного сусла.
Из наших данных следует, что повышенное содержание 2-фенилэтанола в бродящем сусле приводит к увеличению его количества. При повышенном содержании 2-фенилэтанола снижение содержания аминокислот при брожении сусла идет более интенсивно. Эти данные свидетельствуют о возможной взаимосвязи между процессом образования повышенного количества 2-фенилэтанола и снижением содержания аминокислот при биологическом азотопонижении.
В сложении букета большинства типов вин большое значение имеют сложные эфиры. Особенности образования многих сложных эфиров исследованы довольно подробно. Учитывая положительное значение 2-фенилэтанола в сложении аромата вин, внимание исследователей привлекали и его эфиры с органическими кислотами. А. К. Родопуло и сотрудники (1975), С. П. Авакянц (1980) исследовали содержание и количественно определили в шампанских виноматериалах и винах 2-фенилэтилацетат и 2-фенилэтилкапронат. Эти эфиры 2-фенилэтанола определены и в других типах вин.
Согласно данным исследований Б. К. Ранкина и др. (1969), пороговая концентрация 2-фенилэтанола в вине выше 30 мг/л. X. Суомалайнен (1971) установил, что пороговая концентрация 2-фенилэтилацетата в пиве равна 0,65 мг/л. Содержание 2-фенилэтанола в большинстве типов вин колеблется в пределах 10—75 мг/л (Сапис, Риберо-Гайои, 1969) и, следовательно, во многих случаях ниже его пороговой концентрации—30 мг/л. Согласно сведениям И. К. Саписа и П. Риберо-Гайона, искусственное добавление 100 мг/л 2-фенилэтанола не улучшает аромат и придает вину травянистые тона, а добавленный в количестве 1000 мг/л 2-фенилэтанол полностью денатурировал аромат и вкус вина. Авторы считают, что 2-фенилэтанол может участвовать в аромате вин в количествах, в которых он находится, повышение сто концентрации придает вкусу остроту и жгучесть, а аромату — травянистые, несвойственные винам тона.
Однако Е. П. Шольц (1974) обнаружил в мускатном игристом вине «Асти Спуманте» более 100 мг/л 2- фепилэтанола. По-видимому, естественное накопление 2-фспилэтапола при сбраживании виноградного сусла сопровождается образованием других неизвестных компонентов, которые совместно с ним придают этим винам своеобразный аромат. Действительно, К. Черутти и др. (1973), добавляя к виноградному суслу перед брожением фенилаланин в количестве 333 мг/л для сорта Пино белый и 500 мг/л для сорта Бербера, получали вина с превосходным букетом и с улучшенными органолептическими качествами. Авторы предполагают, что 2-фенилэтанол или его эфиры привели к хорошим результатам.
Таблица 30
Влияние фенилаланина, введенного в сусло перед брожением, на образование 2-фенилэтанола и сложных эфиров (мг/л)
Нами совместно с Г. Г. Валуйко, А. А. Налимовой и А. И. Кептине исследовано влияние содержания 2-фенилэтанола в виноградном сусле и вине на образование 2-фенилэтилацетата, 2-фенилэтилкапроиата и других сложных эфиров. Для этого использовали пастеризованный виноградный сок сорта Ркацители и свежеотжатое и осветленное виноградное сусло сорта Траминер розовый, а также вина, выпускаемые винодельческой промышленностью. Брожение проводили в лабораторных условиях при температуре 18—20°С в цилиндрах вместимостью 1 л каждый на расе Кишиневская 341. В сброженном сусле и в винах определяли содержание высших спиртов и сложных эфиров по методике А. А. Налимовой и А. П. Масаловой (1975, 1977). В пастеризованном сусле Ркацители сахаристостью 191 г/л и содержащем 43,31 мг/л фенилаланина перед брожением вводили 330 мг/л фенилаланина. В сброженном сусле (табл. 30) по сравнению с контрольным образцом увеличилось содержание 2-фенилэтанола на 47,83 мг/л. Содержание других высших спиртов незначительно увеличилось. Как в опытном, так и в контрольном образце эфиры 2-фенилэтанола находятся в следовых количествах, намного ниже их пороговой концентрации.
Следует отметить, что увеличение содержания 2-фенилэтанола при брожении не привело к увеличению содержания 2-фенилэтилацетата и 2-фенилэтилкапроиата, а даже к некоторому уменьшению их концентрации. Интересно отметить, что содержание сложных эфиров увеличилось на 0,25 мг/л в опытном образце по сравнению с контрольным в основном за счет этиллаурината. Следовательно, улучшение аромата, полученное и нами в результате добавления фенилаланина, не может быть объяснено накоплением эфиров 2-фенилэтанола.
Для выяснения этого вопроса нами в свежеотжатое осветленное сусло сорта Траминер розовый сахаристостью 199 г/л введено перед брожением 100, 200, 300 и 400 мг/л 2-фенилэтанола. В сусле 2-фенилэтанол содержался в следах. Результаты исследований (табл. 31) показывают, что, несмотря на высокое содержание 2-фенилэтанола в исходном сусле, 2-фенилэтилацетат и 2-фенилэтилкапронат накапливаются при брожении лишь в следовых количествах. Отмечено, что содержание 2-фенилэтилацетата увеличивается на 0,03 мг/л при введении 100 мг/л и на 0,07 мг/л при введении 200 мг/л 2-фенилэтанола. Даже в этих образцах содержание 2-фенилэтилацетата ниже его пороговой концентрации. Содержание этилбутирата, этилэнантата в опытных образцах несколько уменьшается, а этилвалерата, этилкапроната несколько увеличивается. Концентрация этилкаприлата увеличивается на 0,40—0,89 мг/л. Как и при введении в сусло перед брожением фенилаланина, введение 2-фенилэтаиола приводит к увеличению содержания этиллаурината. Отмечено, что чем выше доза введенного 2-фенилэтанола, тем больше накапливается в вине этиллаурината.
Наличие в опытных образцах этиллаурината подтверждено анализом сероуглеродного экстракта из вин на шведском газожидкостном хроматографе-масс-спектрометре LKB-9000. Разделение проводили па колонках длиной 1,2 м и диаметром 0,3 мм, заполненных хромосорбом W, пропитанным 3%-ным SE-30. Спектры получены при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.
Таблица 31
Содержание высших спиртов и сложных эфиров в винах, приготовленных из Сусла винограда Траминер розовый с введением перед брожением 2-фенилэтанола (мг/л)
Результаты исследований обработаны на электронно-вычислительной машине ЕС-10-22 на языке Фортран. Коэффициенты корреляции между содержанием в вине 2-фенилэтанола и содержанием других компонентов приведены в таблице 32. Между содержанием 2-фенилэтанола в винах и содержанием этиллаурината существует положительная корреляционная зависимость
(R=0,95). Коэффициент корреляции между содержанием 2-фенилэтанола и этиллаурината является наибольшим и приближается к единице. Абсолютное содержание этиллаурината в опытных образцах с введением 200—400 мг/л 2-фенилэтанола намного выше его пороговой концентрации, равной, согласно данным Г. И. Козуба и др. (1980)), 0,5 мг/л. Наши исследования свидетельствуют, что одним из основных компонентов, образующихся из 2-фенилэтанола при брожении сусла, является этиллауринат. В то же время можно отметить, что содержание 2-фенилэтилацетата π 2-фенилэтилка- проната не коррелирует с содержанием 2-фенилэтанола. Существует также положительная корреляционная зависимость между содержанием 2-фенилэтанола и содержанием изобутанола (R = 0,69), этилкапроната (R = 0,66), этилвалерата (R = 0,64), этилкаприната (R = 0,51), этилкаприлата (R = 0,42), однако· их абсолютное содержание увеличивается незначительно.
Отмечено, как и в предыдущих наших исследованиях (Каппов, Яцына, 1980), что по сравнению с введенным в сусло перед брожением количеством 2-фснилэтанола его же содержание в вине увеличивается на 35,9— 47,6%. В расчетах из общего содержания 2-фенилэтанола в опытных образцах вычтено его содержание в контрольном образце. Однако для данной серии опытов с суслом винограда Траминер розовый явление автокатализа для 2-фенилэтанола отмечено и при более высоком его содержании в сусле.
Зависимость между содержанием 2-фенилэтанола и содержанием сложных эфиров нами исследована для закарпатских образцов вин из сорта винограда Траминер розовый и Леанка (Фетяска белая) (табл. 32). Для вин с относительно высоким естественным содержанием 2-фенилэтанола — более 20 мг/л — отмечена аналогичная закономерность, что и для образцов вин с искусственным введением его перед брожением.
Для вин из Траминера розового коэффициент корреляции между содержанием 2-феиилэтапола и содержанием этиллаурината является самым высоким и близок к единице (R=0,92). Отмечена положительная корреляционная зависимость между содержанием 2-фенилэтанола и этилкапринатом (R=0,72), этилвалератом (R=0,54), этиллактатом (R=0,42).
В винах из Леанки (Фетяска белая) коэффициент корреляции между содержанием 2-фенилэтанола и содержанием этиллаурината также является самым высоким (R=0,99). Содержание 2-фенилэтанола в винах из данного сорта не коррелирует с содержанием других сложных эфиров. В отдельных образцах вин с содержанием 2-фенилэтанола ниже 20 мг/л коэффициент корреляции между его содержанием и содержанием этиллаурината может быть несколько ниже указанных выше величин.
Таблица 32
Содержание высших спиртов и сложных эфир в в некоторых образцах закарпатских столовых виноматериалов (мг/л)
Следовательно, можно предположить, что основным компонентом, образующимся при брожении из 2-фенилэтанола, является этиллауринат.
Интересно, отметить, что в мускатном игристом вине «Асти Спуманте», содержащем 102,4 мг/л 2-фенилэтанола, этиллауринат, согласно данным Е. П. Шольца (1974), составляет примерно 27% общего содержания этиловых эфиров высших жирных кислот, а в Мускате игристом Севастопольского завода —28%.
Нами проводилась дегустация шампанского виноматериала Алиготе и столового виноматериала Мускат белый с введением 50 и 100 мг/л 2-фенилэтанола. При этом в аромате шампанского виноматериала появились неприятные и нехарактерные травянистые тона. Введение совместно с 50 мг/л 2-фенилэтанола 0,5 мг/л этиллаурината привело к резкому улучшению аромата шампанского виноматериала по сравнению с введением только 2-фенилэтанола. Аромат стал более тонким, однако в нем чувствовались легкие парфюмерные тона. Аналогичные результаты получили при введении 100 мг/л 2-фенилэтанола и 1,0 мг/л этиллаурината, однако в данном варианте парфюмерные тона усилились.
Введение 50 мг/л 2-фенилэтанола в столовый виноматериал Мускат белый приводило к усилению мускатного аромата, а 100 мг/л 2-фенилэтанола еще больше усиливало мускатный аромат, однако он стал менее тонким. Совместное введение 50 мг/л 2-фенилэтанола и 0,5 мг/л этиллаурината усиливает аромат столового виноматериала Мускат белый и делает его исключительно тонким. Аромат виноматериала Мускат белый с искусственным добавлением 100 мг/л 2-фенилэтанола и 1 мг/л этиллаурината стал менее тонким по сравнению с ароматом контрольного образца, в нем появились парфюмерные тона.
Результаты дегустации показали, что введение только 2-фенилэтанола в больших дозах 50 мг/л и 100 мг/л не улучшает аромат вина, особенно Алиготе, а сообщает ему посторонние тона. Совместное введение 2-фенилэтанола и этиллаурината в соотношение 100:1 (примерно такое соотношение между 2-фенилэтанолом и этиллауринатом в винах) в винах делает их аромат тоньше, чем при введении одного 2-фенилэтанола.
Получение усиленного и исключительно тонкого аромата столового виноматериала Мускат белый, в котором введены 2-фенилэтанол и этиллауринат, подтверждает наше предположение, что этиллауринат образуется из 2-фенилэтанола при брожении и коррелирует с его содержанием.
Таким образом, этиллауринат является основным вторичным ароматическим компонентом, содержание которого коррелирует с содержанием 2-фенилэтанола. Показано, что 2-фенилэтиловый спирт играет положительную роль в аромате вин, где его содержание высокое, в основном, благодаря наличию в них этиллаурината.
