Ферменты

Оглавление
Ферменты
о-Дифенолоксидаза
Аскорбатоксидаза
Оксидаза диоксифумаровой кислоты
Цитохромоксидаза, гликолатоксидаза, глюкозооксидаза
Пероксидаза, каталаза, анаэробные дегидрогеназы
Гидролизы

Глава 4
ФЕРМЕНТЫ
Энзимология — наука о ферментах, так называемых биологических катализаторах белковой природы, которые образуются в любой живой клетке и обладают специфической способностью активировать различные химические реакции.
Энзимы имеют большое практическое значение во многих отраслях промышленности и особенно в пищевых: винодельческой, спиртовой, пивоваренной, производстве органических кислот, витаминов и др. Свойства энзимов и механизм их действия привлекают к себе внимание химиков и технологов для разработки новых технологических процессов при производстве различных пищевых продуктов. Для осуществления этих процессов необходимо широко применять ферментные препараты.
В последнее время в США, ФРГ, СССР и других странах созданы фирмы, выпускающие около 200 видов высококачественных ферментных препаратов и кристаллических чистых ферментов.

Коферменты

Получение высокоочищенных ферментов дало возможность установить, что многие из них являются двухкомпонентными и состоят из белка и простетической группы, представляющей собой производное ряда витаминов — это так называемые коэнзимы.
История коферментов начинается в начале XX в. Так, например, А. Гарден и В. Юнг в 1905 г. обнаружили термостабильный небелковый фактор, необходимый для брожения, получивший название козимазы.
Спустя 30 лет в лаборатории О. Варбурга была расшифрована химическая природа коэнзима зимазы. Оказалось, что она состоит из двух коэнзимов: НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДО (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Действующим началом в них является никотинамидное кольцо, участвующее в окислительно-восстановительных реакциях.
Большое число дегидрогеназ, катализирующих важные процессы метаболизма в живой клетке, содержат НАД и НАДФ. Эти два кофермента участвуют в активном центре дегидрогеназ.
Анализ структуры коферментов и данные относительно их взаимодействия со специфическими белками позволяют выделить две функциональные группы: первая — ответственная за связывание с белком, т. е. с ферментом, вторая — обладает каталитической активностью.

Специфичность и механизм действия ферментов

Специфичность ферментов в отличие от неорганических катализаторов огромна. Энзимы катализируют строго специфические реакции. Если энзим катализирует превращение одного субстрата, то говорят, что он обладает абсолютной специфичностью. Если фермент действует на ряд . веществ, имеющих одинаковые атомные группировки в молекуле субстрата, то такое действие называют групповой специфичностью.
Например, пируватдекарбоксилаза, катализирующая декарбоксилирование пировнноградной кислоты в уксусный альдегид и углекислоту, способна декарбоксилировать кетокислоты с более длинной углеродной цепочкой (α-кетомасляную, α-кетовалериановую и др.), но с меньшей скоростью. Пируватдекарбоксилаза действует на одну и ту же группу субстратов, поэтому ее относят к ферментам с групповой специфичностью.
Если фермент катализирует определенные типы реакций, то считают, что он обладает специфичностью по отношению к определенным типам реакций. Примером могут служить эстеразы, которые катализируют распад сложных эфиров с образованием жирной кислоты с более короткой углеродной цепочкой, в то время как другие липазы быстрее катализируют распад сложных эфиров, содержащих остатки жирных кислот с более длинной углеродной цепью.
Если фермент катализирует превращение только одной стереохимической формы субстрата, т. е. если он действует на определенный оптический изомер одного и того же вещества, то это называют стереохимической специфичностью. Примером может служить дегидрогеназа молочной кислоты, которая дегидрирует лишь l-молочную кислоту и не действует на ее d-форму.
В последнее время исследование структурных и функциональных основ энзиматического катализа, т. е. химической динамики активных центров, является одной из новых и наиболее интересных областей современной молекулярной биологии. Недавно стало известно, что каталитические свойства ферментов обусловлены молекулярно-физическими и химическими закономерностями, которые проявляются в особых условиях: в очень сложных структурах макромолекул глобулярных белков.
Для полного изучения молекулярного механизма действия того или иного фермента необходимо установить химическую топографию активного центра самого фермента и образуемых им промежуточных комплексов. Наиболее точную информацию о структуре активных центров ферментов дает рентгеноструктурное исследование кристаллов ферментов и комплексов, образуемых ими с субстратоподобными ингибиторами.
По вопросу механизма действия ферментов известно, что вначале образуется комплекс фермент—субстрат. Хотя это соединение лабильное и быстро распадается, все же благодаря применению специальной методики, при которой спектры поглощения автоматически записываются, удалось за очень короткий промежуток времени проследить за его образованием.
Японские биохимики К. Яги и Т. Озава получили кристаллический препарат комплекса фермента-субстрата для оксидазы α- аминокислоты.
Для того чтобы установить как осуществляется каталитическое действие ферментов, необходимо изучить различные функциональные группы и сопоставить полученные данные с результатами исследования первичной, вторичной и третичной структуры ферментных белков. Это даст возможность иметь представление об активном центре фермента.
Главной составной частью активного центра фермента является так называемый каталитически активный участок, который вступает в непосредственное взаимодействие с субстратом и образует соединение фермент—субстрат.
Таким образом, действие фермента заключается в образовании в активном центре комплекса фермент—субстрат и последующем распределении электронов в этом комплексе, приводящем к ферментативной реакции.
Для примера рассмотрим механизм действия пируватдекарбоксилазы, которая содержится в дрожжах и играет важную роль в образовании углекислоты в процессе алкогольного брожения. В декарбоксилирования пировнноградной кислоты принимает участие тиаминпирофосфат, который состоит из пиримидинового комплекса, тиазолового комплекса и остатка пирофосфорной кислоты. Тиаминпирофосфат участвует в декарбоксилирования пировнноградной кислоты под действием пируватдекарбоксилазы. Пировиноградная кислота взаимодействует с тиазоловым компонентом тиаминпирофосфата и образуется комплекс фермент—субстрат. В дальнейшем происходит распределение электронов в этом комплексе, и он становится лабильным и легко распадается с образованием углекислоты. После этого образуется новый комплекс оксиэтилтиаминпирофосфат, который распадается на уксусный альдегид и на тиаминпирофосфат.
Для отделения молекулы уксусного альдегида от кофермента пируватдекарбоксилазы необходимо разорвать довольно стабильную ковалентную связь С—С. Главным в этом механизме является  освобождение протона α-оксигруппы, что способствует отщеплению альдегидного фрагмента. Скорость всей ферментативной реакции зависит непосредственно от кислотности α-оксигруппы или от способности последней отдавать свой протон.
Оксиэтилтиаминпирофосфат является активным ацетальдегидом, который взаимодействует с липоевой кислотой в процессе окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и других кетокислот. Активный ацетальдегид участвует в конденсации пировиноградной кислоты с образованием ацетомолочной кислоты. Последняя, путем внутримолекулярной перегруппировки, превращается в высшие спирты и аминокислоты.
Некоторые энзимологи сравнивают специфичность ферментов и субстратов с ключом и замком. Так, например, Э. Фишер считает, что фермент подходит к своему субстрату совершенно так же, как ключ к замку. Он полагал, что фермент имеет строго определенную структуру: если субстрат не подойдет к этой структуре, то в этом случае фермент не действует.
Не так давно было высказано предположение, что конформация молекулы фермента и его активного центра могут изменяться под влиянием коэнзима и субстрата, так как присоединение их к ферменту может вызвать изменение конформации молекулы фермента, а следовательно, его физико-химических свойств.
С другой стороны, считают, что действие ферментов обусловлено снижением энергии активации, необходимой для протекания данной энзиматической реакции. Например, разложение перекиси водорода на кислород и воду (2Η2O2→2Η2O+O2) осуществляется без фермента с затратой 18 тыс. малых калорий на 1 г-мол, а в присутствии фермента каталазы —всего лишь до 1500 малых калорий. Из этого примера ясно, что фермент снижает энергию активации.
Известно, что, для того чтобы молекулы действующих масс вступили в реакцию, они должны быть активированы. Одним из способов их активирования является повышение температуры. При этом число молекул увеличивается, они находятся в активном состоянии и скорость реакции при этом повышается. Скорость реакции можно поднять до оптимальной величины. При высокой температуре (выше 50°С) происходит снижение скорости ферментативной реакции в результате разрушения белка, т. е., происходит его денатурация. Исходя из этого, важным показателем, характеризующим отношение белка к температуре, является его термостабильность.
Известно, что для действия фермента необходима какая-то определенная химическая группировка, которая бы характеризовала его активность. Для действия фермента также может быть необходима не одна активная химическая группировка, а несколько специфических групп, расположенных строго определенным образом в молекуле фермента.
Для того чтобы узнать, какие специфические и функциональные группы фермента участвуют в проявлении каталитического действия фермента, необходимо применить ингибиторы. Для ингибирования окислительно-восстановительных ферментов, которые содержат в своей молекуле железо и медь, применяют синильную кислоту. Она ингибирует окислительные ферменты — каталазу пероксидазу и цитохромоксидазу, — которые содержат в простетической группе железо. Специфическим ингибитором является диэтилдитиокарбамат. Ингибирующее действие оказывает на фермент о-дифенолоксидаза, содержащая в своей молекуле медь.
Другим способом изучения активных функциональных групп ферментов является химическая модификация: окисление функциональной группы, замещение карбоксильной группы на эфирную и др. Применяют также блокировку активных функциональных групп специфическим реактивом. Так, например, для блокирования SH-группы ферментов применяется n-хлормеркурибензоат. Например, лактатдегидрогеназу, которая содержит SH-гpyппу, постепенно можно ингибировать, применяя различные дозы n-хлормеркурибензоата. Алкогольдегидрогеназа ингибируется п-хлормеркурибензосульфонатом, так как содержит около 28 свободных SH-групп.
Таким образом, главным фактором эффективности и специфичности ферментативного катализа является сложная структура белковой молекулы фермента со свойственным ей многообразием активных функциональных групп.
Известно, что клетка имеет сложную структуру и содержит разнообразные органеллы: ядра, митохондрии, пластиды, рибосомы, лизосомы и др. При исследованиях, проведенных с помощью электронного микроскопа, выяснено, что эти органеллы имеют весьма сложную структуру. В живой клетке ферменты действуют в сложной гетерогенной среде и значительная часть их связана с мембранами. Еще в 1947 г. А. И. Опарин впервые высказал предположение, что действие ферментов зависит от структурной организации протоплазмы. Согласно этой теории, ферменты в живой клетке частично находятся в свободном (растворенном) состоянии, частично адсорбированы на поверхности протоплазменных структур. От состояния данного фермента в клетке зависит направленность ферментативных процессов в организме.
В винограде и вине содержатся оксидоредуктазы и гидролазы. К оксидоредуктазам относятся анаэробные и аэробные дегидрогеназы.



 
< Органические кислоты   Витамины >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх