Превращения в винограде - Протеазы

До последних лет знание процессов протеолнтической активности виноградного сока было очень ограниченным (Пантанелли, 1911; Бальони и сотрудники, 1937). Недавно опубликованные интересные работы Кордонье (1971) дали более точное представление по этому вопросу (Кордонье и Дю-галь, 1968).

Структура протеинов

Следует напомнить, что протеины и пептиды состоят из цепей аминокислот, соединяющихся между  собой  очень специфичной    связью     (пептидной)  образованной между группой  органической кислоты и атомом водорода а минной группы.

Роль протеаз

Протеазы или пептидазы — это ферменты, ответственные за гидролиз пептидной связи. В результате гидролиза происходит или высвобождение аминокислот, если гидролиз происходит в конце цепей (экзопротеазы), или высвобождение пептидов с меньшей молекулярной массой, чем у первоначальной молекулы, если гидролиз происходит внутри цепи (эндопротеазы).  Экспериментально действие протеаз выражается в увеличении  концентрации -азота, растворенного в трихлоруксусной кислоте, в форме, в   которой  он легче всего усваивается микроорганизмами.

Рис 2.23. Протеазные активности винограда  гидролиз гемоглобина суслами из здорового и загнившего винограда сортов Кариньян и Драмой при рН 2,0 и температуре 50°С (Кордонье и Дюгалъ, 1968)]:
1 — Кариньян пораженный плесенью; 2 — Арамон, пораженный плесенью; 3 — Кариньян здоровый; 4 — Арамон здоровый; 5 — контроль. Кариньян здоровый.

 Такое действие ферментов можно измерять или колориметрическим способом, или, что проще,   определением общего азота, растворимого в трихлоруксусной кислоте после минерализации по способу Кьельдаля. Очевидно, что для этого следует создать вполне определенные условия: рН 2,0 и температуру 55°С, используя в качестве субстрата белок — обычно 5%-ный гемоглобин в буфере цитрата с рН 2,0.
Значение протеазной или протеолитической активности показано на рис. 2.23, заимствованном из работы Кордонье и Дюгаль (1968).

Локализация активности протеаз в винограде

Измеряя протеазные активности различных партий винограда по способу Кордонье и Дюгаля (1968), можно составить табл. 2.13, из которой видно, что большая часть активностей здорового винограда находится в соке с мезгой.
Таблица 2.13
Распределение протеазных активностей в различных частях здорового винограда (Кордонье и Дюгаль, 1968)

* Активность определяют в миллиграмм-эквивалентах азота, высвобожденного за 4 ч гидролиза при рН 2,3 и 65°С на ацетоновом порошке ягоды и ее различных компонентов.
Гниль на ягодах вызывает глубокие изменения активности. Действительно, тогда как большая часть протеолитических активностей здорового винограда ассоциируется с твердыми частями ягоды, большая часть этих активностей у винограда с гнилью находится в соке. С точки зрения технологии это различие представляет определенный интерес, так как оно указывает на обогащенность протеазной активностью осаждающихся частиц в сусле из здорового винограда (табл. 2.14).
Таблица 2.14
Протеазные активности (в %) различных сортов винограда (Кордонье и Дюгаль, 1968)

Факторы, влияющие на активность протеаз

Из основных факторов, влияющих, на активность протеаз сусла, необходимо указать на рН, температуру, сернистый ангидрид и др., менее значительные.
рН. Как видно из рис. 2.24, максимум воздействия рН соответствует около 2,0, что указывает на большую стойкость ферментов по отношению к кислым рЫ. С другой стороны, отмечают, что в зоне рН сусел активность составляет 40—60% от максимальной, чем можно объяснить изменения ассимиляции азота дрожжами в зависимости от большей или меньшей зрелости собранного винограда.
Температура. Из рис. 2.25 видно, что максимум активности приходится на 55°С и можно констатировать, что при более высоких температурах (например, 70°С) ферментативная активность не прекращается.

Рис. 2.24. Влияние рН на протеазную активность сусел.

Протеазы такого типа обладают высокой термоустойчивостью, поскольку они не разрушаются и при температуре 80°С. На рис. 2.26 дана кривая разрушения фермента в зависимости от температуры и продолжительности нагревания 15 и 30 мин при рН 3,15, который является средним рН сусел. Здесь также отмечается высокая устойчивость протеаз к действию повышенных температур.
Сернистый ангидрид. Влияние его на активность протеаз наглядно видно на табл. 2.15. Активности измеряли при рН 2,0 (оптимальный) и 3,15 (средний рН сусел).
Наблюдается отчетливо выраженное активирующее действие SO2 на здоровый виноград главным образом при дозах примерно 25 мг/л. Причем оно более значительно при пониженном рН. На винограде с гнилью это действие всегда проявляется в меньшей степени и при рН 2,0 оно становится равным нулю, тогда как результаты, полученные при рН 3,15 для доз 25 и 50 мг/л, почти идентичны.

Рис 2.25. Влияние температуры на протеазную активность сусел.

Рис 2.26. Влияние температуры и продолжительности нагревания (в мин) на протеолитическую активность виноградного сока:
1 — 15; 2-30.

Действие малых доз S02 на ферментативную активность здорового винограда небезынтересно с точки зрения технологии, поскольку она может объяснить, по меньшей мере, частично активирующее действие небольших количеств SO2 в случае дображивания сусла из винограда красных сортов после остановки брожения. Различие между здоровым и загнившим виноградом может быть результатом очень быстрого связывания SO2 во втором случае, когда он находится только в свободной форме, играющей роль активатора.

Рис. 2.27. Изменение протеазных активностей в ягоде в период ее развития:
1 — Кариньян (11.5% об.); / — 30 нюня; 2—13 июля;
3 — 29 июля; 4, 5—19 августа; 6" —7 сентября.
11 — Мускат   александрийский (12,8% об.);   7, 3 —
4 сентября; 9. /0 — 11 сентября.

Другие факторы. Нужно указать, что не отмечено никаких более или менее значительных различий в зависимости от сорта. Действие бентонита, по-видимому, проявляется неодинаково, как это вытекает из табл. 2.16.
Таблица 2.15
Влияние S02 на протеазные активности винограда (Кордонье и Дюгаль, 1968)

Активности измеряли после 2 ч гидролиза при рН 2,0 и температуре 55°С.
Таблица 2.16
Действие бентонита на протеазные активности (Кордонье и Дюгаль, 1968)

Активности измеряли после 2 ч гидролиза при рН 2,0 и 55°С,
В процессе своего развития ягоды на зеленой стадии роста обладают слабой протеолитической    активностью,
которая мало изменяется до начала созревания. В период с начала созревания и до достижения зрелости констатируют резкое увеличение активности, которая продолжается и в период перезревания, но в меньшей степени (рис. 2.27).
Показанные концентрации SO2 соответствуют тем, которые реализуются в инкубационной смеси фермент — субстрат.
Спиртовое брожение. По-видимому, оно не вызывает заметного уменьшения активности ферментов, поскольку через 2 мес после брожения вино, хранившееся после удаления дрожжевого осадка, все еще сохраняет половину первоначальной общей протеазной активности.

Технологическое значение протеаз

Бесспорно, что более глубокое знание протеаз и факторов, усиливающих их действие, таких, как сернистый ангидрид, рН и температура, позволяют лучше объяснить некоторые явления в виноделии, природа которых зачастую остается невыясненной, как, например, активация спиртового брожения небольшими дозами SO2 или предварительным подогревом винограда красных сортов.