Природа яблочно-молочного фермента
Молочнокислые бактерии, выделенные из вин, обладают различными способностями по превращению яблочной кислоты в молочную. Их клетку можно рассматривать как носитель более или менее значительного потенциала «яблочно-молочной активности» или «яблочно-молочного фермента», причем последний термин выражает ферментный комплекс, вызывающий яблочно-молочное превращение (см. гл. 15 «Механизм брожения»).
Этот яблочно-молочный фермент может иметь «конститутивный» или «индуктивный» характер. Конститутивным его называют потому, что он является интегрирующей и постоянной частью ферментного запаса клетки, а индуктивным потому, что, не существуя в клетке в момент ее возникновения, может быть индуцирован в среде веществ как раз таких, которые он способен метаболизировать, в данном случае яблочную кислоту; таким образом, этот фермент является случайным.
Уайтинг и Коггинс (1963) определили свойства яблочно-молочного фермента 8 штаммов, выделенных из вин. С. Лафон-Лафуркад и Пейно (1970) исследовали 100 штаммов молочнокислых бактерий: они получили распределение, которое показано в табл. 12.3.
Таблица 12.3
Природа яблочно-молочного фермента молочнокислых бактерий, выделенных из вин
Активность штаммов | Бациллы | Кокки | ||
гомоферментативные | гетероферментативные | гомоферментативные | гетероферментативные | |
Фермент яблочно-молочный |
|
|
|
|
конститутивный | 9 | 18 | 5 | 47 |
индуктивный | 5 | 0 | 1 | 5 |
Штаммы, лишенные яблочно-молочного фермента |
| 10 |
|
|
В условиях эксперимента 10% штаммов не обладали активностью декарбоксилирования яблочной кислоты. Среди бактерий с яблочно-молочным ферментом индуктивного типа оказалось 64% гомоферментативных или гетероферментативных бацилл. У кокков число штаммов повышается; оно достигает 83% для гомоферментативных и 86% для гетероферментативных кокков, следовательно, природа яблочно-молочного брожения скорее является признаком штамма, чем вида.
Разложение яблочной кислоты молочнокислыми бактериями, не размножающимися делением
Если в простой раствор яблочной кислоты внести достаточное массовое количество свежевыделенных путем центрифугирования и промытых молочнокислых бактерий, то через несколько часов можно наблюдать превращение яблочной кислоты в молочную; например, свежие бактерии в концентрации 1 г/л превращают в течение 24 ч 50 мг-экв яблочной кислоты. На основе этого можно разработать тест яблочно-молочной активности бактериальных клеток, не размножающихся делением (Лафон-Лафуркад, 1970).
Среда для эксперимента состоит из фосфатного буфера, обогащенного некоторыми катионами и не содержащего никаких других органических веществ, кроме L-яблочной кислоты; серия опытов, которые описаны ниже, побудила авторов установить рН, равный 4,0.
Вторичный фосфат калия, г/л 2,0 Сульфат магния, г/л 0,125
Сульфат марганца, г/л 0,125
L-яблочная кислота, мг/экв от 50 до 60
Экспериментальную среду распределяют по пробиркам из расчета по 10 см3 в каждую и стерилизуют при 115° С в течение 10 мин. После охлаждения суспензии засевают с определенной массой промытых бактерий, собранных из среды предварительной культуры путем центрифугирования при частоте вращения 9000 об/мин и температуре 0°С; ставят на инкубацию при 30° С. Количественный анализ общей кислотности проводят через одинаковые промежутки времени после удаления углекислого газа путем взбалтывания под вакуумом. Разница в кислотности основной среды до и после добавления яблочной кислоты позволяет вычислить точное содержание этой кислоты в среде. Исчезновение половины процентного содержания кислоты в экспериментальной среде означает завершение яблочно-молочного брожения.
