Микроклональное размножение винограда

Биология культивируемых клеток и биотехнология растений: Сборник статей под ред. Р.Г. Бутенко М.: Наука, 1991. 216-220с.
УДК 581.143.6

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ВИНОГРАДА
А. Б. БУРГУТИН

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР,
Москва

К микроклональному размножению можно отнести массовое бесполое размножение растений в условиях асептики, позволяющее исключить появление генетически измененных форм [7]. Успешному размножению растений in vitro на практике предшествовала работа по технике культивирования изолированного апекса побега. Морель одним из первых начал успешно культивировать апикальные меристемы многих видов растений (картофель, георгины, орхидеи, подсолнечник, гвоздика) [11, 22]. Р. Г. Бутенко изучала физиологию изолированных верхушечных почек стеблей периллы, фарбитиса, рудбекии, картофеля, сои [4]. Оздоровление винограда с помощью культуры апикальной меристемы с привлечением термотерапии начато Галзи [19, 20], и оно не потеряло актуальности до сих пор [18]. В СССР работы по размножению винограда in vitro ведутся с начала 1980-х годов [1, 3, 5].
Для винограда показаны три пути получения микропобегов.

1. Микрочеренкование одиночного побега (с одновременным укоренением), полученного от введенной в культуру изолированной почки (меристемы).
2. Длительная культура пролиферирующих побегов, или активация пазушных меристем (этап размножения) с последующим разделением побегов и их укоренением на иной по составу среде.
3. Получение эмбриоидов из каллусной ткани и регенерация из них растений.

Для поддерживающей селекции (питомниководство) без опасности повышения изменчивости можно рекомендовать первый из перечисленных путей [21], который мы используем в своей работе [3], тем более что этот путь наиболее разработан технологически. Генетическая стабильность материала, полученного вторым путем, проверяется [21, 24], поскольку длительная культура пролиферирующих побегов с индукцией развития пазушных почек первого, второго и последующих порядков с помощью цитокинина не исключает появления адвентивных побегов (т. е. образования побегов de novo). Так, оптимизм ранних работ по микроразмножению земляники с использованием цитокинина [13] сменился (у того же автора) реальными оценками — при увеличении числа асептических субкультур в поле регистрируют мутанты и значительное снижение урожая ягод [14]. Известно и прямое указание для винограда о повышенной изменчивости при таком способе размножения [16]. Выявление возможных генетических нарушений может быть отодвинуто во времени к генеративному периоду, что недопустимо для плодовых и винограда, так как обнаружение отклонения от сортовых признаков в многолетних насаждениях будет обесценивать производственные посадки.

Эмбриогенез как адвентивный процесс ведет у винограда к появлению форм с отклонениями от исходной [6, 9]. Исходя из изложенного выше, эмбриогенез может быть рекомендован как раз для получения разнообразия, но не для целей питомниководства такой важной сельскохозяйственной культуры, как виноград, для которой генетическая нестабильность, вызванная, в частности, анеуплоидией, может стать причиной пониженной фертильности, не говоря уже об изменении других технологических признаков сорта.

Таким образом, микрочеренкование, по-видимому, найдет в практике питомниководства винограда наибольшее применение, хотя предложены и другие пути, основанные на культуре пролиферирующих побегов при высоких концентрациях цитокининов [6], хотя с последним мы согласиться не можем.
Следует подчеркнуть, что полностью отказаться от применения цитокинина пока не представляется возможным и для первого из предложенных путей, хотя это применение и ограничивается всего одним (нулевым) пассажем — культивирование изолированной меристемы. При введении же образца в культуру in vitro крупным эксплантом (часть побега, почка), когда не стоит задача оздоровления, необходимость применения цитокинина отпадает полностью [10, 15], если предполагается вести размножение микрочеренкованием.

При размножении микрочеренкованием приходится считаться с особенностями винограда как древовидной лианы — не все черенки дают побег одновременно, как это имеет место для травянистых (например, картофель). Если черенок взят не из ювенильной, не из верхушечной части побега, то его развитие (укоренение, побегообразование) отстает. Часть черенков не дает побегов совсем. Последнее зависит от генотипа. Так, формы Подарок Магарача и Кобера 5ББ дают до 100% побегов при микрочеренковании, а для сортов Ркацители, Ананасный характерны цифры 70 и 60% соответственно.

При масштабировании процесса имеет значение депонирование при низких положительных температурах [21]. Мы испытали метод холодного хранения для ряда генотипов (Подарок Магарача, Кишмиш белый и др.). Все испытанные сорта были возобновлены после 8 мес хранения при температуре 12—15° в камере фитотрона  ИФР АН СССР.

В любом случае эффективность размножения такова, что позволяет получать в год от одной инициали сотни тысяч пробирочных растений.
Детально остановиться на всех моментах, связанных с культивированием растений in vitro, не позволяют рамки данного сообщения. Общие положения подробно освещены как в зарубежных [17, 25], так и в отечественных руководствах [4, 7]. Многие моменты технологии размножения винограда in vitro представлены в уже упоминавшемся выше пособии [6]. И все же мы считаем необходимым остановиться на некоторых аспектах нашего личного опыта работы с виноградом.

Питательные среды.

С равным успехом были испытаны питательные среды на основе прописей неорганических солей, используемых рядом авторов [6, 8, 21, 24]. При сравнении их в эксперименте мы остановились на уже использованной нами прописи [3], основанной на неорганических компонентах по Мурасиге и Скугу [23] с введением ИУК в концентрации 0,1— 0,2 мг/л. При культивировании апикальных меристем ауксин в этой прописи заменяется на цитокинин (БАП в концентрации 1 — 2 мг/л). Считаем, что при введении в культуру in vitro первые субкультивирования предпочтительнее проводить в прозрачных твердых средах (агар-агар) — так эффективнее осуществить контроль контаминации. При получении развитого побега дальнейшие субкультивирования можно проводить и в непрозрачных (активированный уголь, искусственные смолы и другие наполнители: песок, целлюлоза и т. д.) и жидких средах, если в этом будет необходимость.

Перевод растений в почвенную культуру.

Мы применили приемы, позволяющие значительно упростить технологию перевода растений в почвенную культуру [2]. По существующей технологии растения in vitro проходят адаптацию к условиям климатической камеры или оранжереи после извлечения их из пробирок (колб). Для винограда такой подход не позволяет отказаться от создания влажной камеры в первый период адаптации, как это удается, например, для картофеля [12]. Нежные ткани листочков пробирочного растения винограда вянут и некротизируют без влажной камеры (вариант — мелкокапельное опрыскивание).
Мы применили другой подход, позволяющий обойти существующие трудности. Адаптацию к условиям климатической камеры или оранжереи растения безболезненно проходят в пробирках — для этого достаточно снять пробки с тех пробирок, в которых побег достиг пробки. В таком состоянии растения оставляют на 1,5 — 2 нед. Чтобы предотвратить образование плесеней на агаризованной среде, достаточно 3 — 4 раза за этот период полить растения водопроводной водой — увлажнить поверхность агара и лишнюю воду слить, перевернув пробирку. В конце указанного периода верхушка растения и один-два развитых листочка будут вне пробирки. Такое растение готово к пересадке в почву. Растение следует пересаживать с агаризованной средой — так меньше повреждается корневая система. Необходимо заглублять побег в почвенный субстрат так, чтобы над поверхностью оставалась верхушка с одним-двумя развитыми листочками. Туманообразующая установка или влажная камера не требуются. Чтобы защитить растение от патогенов следует применять стерильный почвенный субстрат или речной песок, свободный от нематод, а помещение изолировать от насекомых-переносчиков болезней.

Данной технологией неоднократно испытаны следующие формы: Магарач 124-66-14, Ркацители, Кишмиш белый (Хисрави), Тайфи розовый, Кобера 5ББ, Мускат янтарный, Крымская жемчужина. Последние два сорта переданы нам А. И. Шелякиным (Отдел виноградарства республиканской сельскохозяйственной опытной станции Чечено-Ингушской АССР, Грозный). Из более чем 200 пересаженных таким образом растений не было ни одного выпада. Растения сорта Ркацители, высаженные из пробирок в 1988 г., дали урожай ягод в 1989 г. в условиях оранжереи ИФР АН СССР.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абраменко Н. М. Изучение возможности ускоренного размножения винограда в культуре in vitro // Вирусные, микоплазменные и бактериальные болезни плодовых культур и винограда в Молдавии. Кишинев, 1980. С. 100 — 105.
2. Бургутин А. Б. Микроклональное размножение винограда: Перевод растения в почвенную культуру // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Междунар. конф.: Тез. докл. Новосибирск, 1988. Т. 2. С. 312.
3. Бургутин А. Б., Бутенко Р. Г., Катаева Н. В., Голодрига П. Я. Быстрое клональное размножение виноградного растения // С.-х. биология. 1983. № 7. "С. 48—50.
4. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. 272 с.
5. Голодрига П. Я., Зленко В. А., Бутенко Р. Г., Левенко Б. А. Ускоренное размножение ценных генотипов винограда // Садоводство. 1982. № 3. С. 24 — 27.
6. Голодрига П. Я., Зленко В. А., Чекмарев Л. А. а др. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. Ялта, 1986. 56 с.
7. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука, 1983. 96 с.
8. Литвак А. И., Кузьменко А. П.. Гузун Н. П., Минакова Р. И. Технология клонального микроразмножения винограда // Питомниководство — решающий фактор развития виноградарства: Респ. конф. по питомниководству: Тез. докл. Кишинев, 1985. С. 66 — 67.
9. Марченко А. О., Голодрига П. Я., Клименко В. П., Пивень Н. М. Соматический эмбриоидогенез в культуре ткани винограда // Физиология и биохимия культ. растений. 1987. Т. 19. С. 408—411.
10. Михалевская О. Б., Бургутин А. Б. Почки винограда от побегов разного возраста как исходный материал для микроклонального размножения // Культура клеток растений и биотехнология: Тез. докл. IV Всесоюз. конф. Кишинев: Штиинца, 1983. С. 119.
11. Морель Ж. Борьба с вирусными болезнями с помощью культивированных тканей // С.-х. биология. 1967. Т. 2. С. 622 — 628.
12. Трофимец Л. Н., Остапенко Д. П., Бойко В. В. и др. Оздоровление и ускоренное размножение семенного картофеля: (Метод. рекомендации). М.: ВАСХНИЛ, 1985. 36 с.
13. Boxus Ph., Quoirin М., Laine J. M. Large scale propagation of strawberry plants from tissue culture // Applied and fundamental aspects of plant cell, tissue, and organ culture. B. etc.: Springer, 1977. P. 130 — 143.
14. Boxus Ph. Cornportement du fraisier issu de micropropagation in vitro: Aspects pratiques actuels // Fruit beige. 1985. Vol. 53. P. 106 ― 110.
15. Burgulin А. В., Butenko B. G., Mekhalevskaya О. В. Grapevine multiplication in vitro // Plant tissue and cell culture-application to crop improvement: Intern. symp.: Abstracts. Olomouc, 1984. P. 19.
16. Cancellier S., Cossio P. Risultati di osservazioni su un clone di'Corvina Veronese (Vitis vinifera L.) moltiplicato attraverso la coltura in vitro // Riv. vitic. enol. 1988. Vol. 41. P. 110—117.
17. Dodds Т., Roberts L. Experiments in plant tissue culture. Cambridge: Cambridge Univ. press, 1985. 232 p.
18. Duran-Vila N., Juarez J., Arregue J. M. Production of viroid-free grapevines by shoot tip culture // Amor. .J. Enol. and Viticult 1988. Vol. 39. P. 218—220.
19. Galzy R. Confirmation de la nature virale du courtnoue dc la vigne par des essais de thermotherapie sur des cultures in vitro // C. r. Acad. sci. D, 1961. Vol. 253. P. 706—70Б.
20. Galzy R. La culture in vitro des apex de Vitis rupestris // Ibid. 1972. Vol. 274. P. 210—213.
21. Galzy B. Les possibilites de conservation in vitro d'une collection dc vignes // Bull. 0. I. V. 1985. Vol. 58, N 650/651. P. 377—390.
22. Morel G., Martin C. Guerison de dahlias atteints d'une maladie a virus // C. r. Acad. sci. I). 1952. Vol. 235. P. 1324—1325.
23. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. plant. 1962. Vol. 15. R. 473 — 497.
24. Novak F. J., Javova Z. Clonal propagation of grapevine through in vitro axillary bud culture // Sci. hort. 1982. Vol. 18. P. 231—240.
25. Plant cell culture: A practical approach/Ed. R. A. Dixon. Oxford: IRL press, 1985. 236 p.