Главная >> Статьи >> Антоциановые профили в каллусной культуре и ягоде окрашенных сортов винограда

Антоциановые профили в каллусной культуре и ягоде окрашенных сортов винограда

УДК 634.85:547.973:57.085.23
АНТОЦИАНОВЫЕ ПРОФИЛИ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ И ЯГОДЕ ОКРАШЕННЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА
С. Гориславец, В. Рисованная, О. Сиказан Институт винограда и вина «Магарач», Украина, г. Ялта
Представлены результаты двухлетних исследований антоциановых профилей в ягоде и каллусной культуре винограда. Изучено 5 технических сортов винограда с окрашенной ягодой. Идентифицировано 8 антоцианов, определенных методом HPLC: petunidin, peonidin, malvidin, delphinidin 3-glucoside, cyanidin 3-glucoside, petunidin 3-glucoside, paeonidin 3-glucoside, malvidin 3-glucoside. Ha примере сорта Каберне Совиньон показана зависимость интенсивности синтеза антоцианов от климатических условий года и места произрастания. Влияние этих условий на качественный состав антоцианов сорта не выявлено. Подбор фитогормонов и условий культивирования позволил индуцировать синтез антоцианов в каллусной культуре данных сортов. Интенсивность синтеза антоцианов значительно зависела от освещенности и концентрации экзогенных фитогормонов НУК, БАП и 2,4-Д в питательной среде.

Введение. Антоцианы относятся к группе флавоноидов, представляющих большой класс вторичных метаболитов растений. В клетках антоцианы находятся преимущественно в виде гликозидов. Их агликоны, получившие название антоцианидинов, связаны преимущественно с сахарами глюкозой, галактозой, рамнозой. Антоцианы в клетках обычно растворены в клеточном соке и аккумулируются » в вакуолях. Благодаря разнообразию строения и высокой реакционной способности антоцианы выполняют в растении разнообразные важ-

ныс функции, которые обсуждаются и изучаются до настоящего времени. Вопросам путей биосинтеза антоцианов у высших растений, их генетике и биохимии посвящен ряд обзоров [1,2].
Культивируемые в условиях in vitro клетки высших растений сохраняют способность к синтезу вторичных соединений, в том числе и фенольной природы, хотя содержание фенольных соединений в клеточных культурах обычно ниже, а состав менее разнообразен. Благодаря контролируемым условиям, тотипотентности культивируемых клеток и их быстрой реакционной способности клеточная культура растений представляет собой удобную модель для изучения не только морфогенетических процессов, но и процессов синтеза вторичных метаболитов и, в частности, антоцианов. В роли индукторов синтеза в клетках вторичных веществ могут выступать различные контролируемые физические и химические условия выращивания, такие как температура, углеводы [3, 4], фигогормоны, освещенность [5, 6] и др.
Цель нашей работы заключалась в оценке антоциановых профилей в ягоде технических сортов винограда и возможности индукции синтеза антоцианов в каллусной культуре этих сортов.
Материалы и методы. Для анализа были отобраны гибридные сорта технического направления использования: грузинский аборигенный сорт Саперави, сорт Каберне Совиньон и 3 гибридных сорта селекции ИВиВ «Магарач», для которых они являются родительскими формами: Антей магарачский, Рубиновый Магарача и Гранатовый Магарача. У всех изученных сортов окрашена кожица ягоды, а у сорта Гранатовый Магарача - окрашен сок.
Культивирование растений in vitro проводили в условиях 16- часового фотопериода (3000 лк) при температуре 25 °С. В работе использованы общепринятые методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений [7], а также методы, разработанные специально для культуры винограда [8, 9]. Подготовку пробы ягод для анализа проводили в соответствии с методикой [10]. Для культуры ткани методика экстракции была модифицирована (готовится к печати).
Разделение антацианов проводили на жидкостном хроматографе Agilent Technologies, на колонке Supelcosil LC-18DB 250x2.1. Для идентификации антоцианов использовался сухой экстракт черники, с содержанием красящих веществ 25,7% [12]. Разделение проводилось в градиентном режиме от 0 до 55 мин.
Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований были проанализированы антоциановые профили в ягоде 5 сортов винограда, собранных в 2003-2004 гг. на ампелографической коллекции ИВиВ «Магарач», западнопредгорная зона Крыма, Предгорное Опытное Хозяйство (ПОХ). Годы проведенных исследований значительно отличались по количеству суммы активных температур и выпавших осадков. Полученные результаты анализа качественного и количественного состава антоцианов изученных сортов представлены в таблице.

Содержание антоцианов в ягоде сортов винограда, произрастающих в западнопредгорной зоне Крыма


Сорт

Год сбора

Delphinidin- 3-O-Glu, mg/1

Cyanidin- 3-O-Glu, mg/1

Petunidin3- O-Glu, mg/1

Peonidin-
3-O-Glu, mg/1

Malvidin
3-O-Glu, mg/1

Petunidin, mg/1

Peonidin, mg/1

Malvidin,
mg/1

Рубиновый Магарача

2003

0.08

0.04

0.28

0.17

1.65

0.09

0.03

0.32

Рубиновый Магарача

2004

0.18

0.60

0.94

1.47

5.68

0.04

0.11

0.36

Каберне Совиньон

2003

0.18

0.01

0.02

0.04

0.04

0.02

0.02

0.06

Каберне Совиньон

2004

0.05

0.08

0.41

0.95

4.56

0.06

0.09

0.63

Антей
магарачский

2003

0.05

0.02

0.06

0.15

0.74

0.02

0.03

0.21

Антей
магарачский

2004

1.34

0.75

3.00

5.99

21.85

0.37

1.4

6.60

Саперави

2004

1.81

3.05

4.00

8.66

20.97

0.07

0.57

1.45

Гранатовый Магарача

2003

0.02

0.01

0.04

0.52

1.62

0.01

0.09

0.19

Гранатовый Магарача

2004

0.07

0.04

0.12

0.76

1.63

0.05

0.15

0.09

Как видно из таблицы, спектр синтезируемых антоцианов в разные годы вегетации оставался неизменным, а интенсивность варьировала в значительных пределах в зависимости от сорта и года вегетации. В ягоде изученных сортов выявлено 3 антоцианидина (петунидин, пеонидин и мальвидин) и пять основных гликозидов антоцианидинов с наибольшим накоплением мальвидин-бета-гликозида у всех сортов. В 2004 году уровень накопления антоцианов значительно превышал данные показатели в 2003 году у всех изученных сортов. Хроматограммы, отражающие зависимость интенсивности синтеза гликозидов антоцианидинов от климатических условий года на примере сорта Каберне Совиньон, представлены на рис. 1.
Хромагограмма MPLS
Рис. I. Хромагограмма MPLS. Антоциановые профили в ягоде сорта Каберне Совиньон, собранные в разные годы вегетации: хроматограмма Ант 13 (нижняя) - Каберне Совиньон (ПОХ, 2(103), хроматограмма Ант 14 (верхняя) - Каберне Совиньон (ПОХ, 2004)

На примере сорта Антей магарачский изучена зависимость синтеза антоцианов не только от года вегетации, но и от зоны произрастания. Были проанализированы антоциановые профили ягод, отобранных в двух виноградарских зонах в течение 2003-2004 гг: западнопредгорная зона (ПОХ) и южнобережная, (ОПБ - Опытно- производственная база ИВиВ «Магарач»), Содержание антоцианов н ягоде сорта Антей магарачский в 2004 году было значительно выше по сравнению с показателями 2003 года в обоих виноградарских зонах. При этом интенсивность накопления антоцианов в ягоде в запад- нопредгорной зоне 2004 года была в 2-3 раза выше аналогичных показателей в южнобережной зоне по всем выявленным антоцианам, за исключением Cyanidin-3-O-Glu. Это позволяет предположить, что на содержание антоцианов большое влияние оказывают климатические условия произрастания винограда. Полученные результаты и выводы согласуются с данными литературы [13].
Для индукции синтеза антоцианов в клеточной культуре винограда в течение нескольких лет проведена серия экспериментов по отработке оптимальных условий культивирования каллусной культуры винограда. Для получения каллуса отбирали листья растений, растущих in vitro. Использовали модифицированную среду MS, дополненную ПУК, 2,4-Д и БАМ в различных концентрациях. Было изучено 18 вариантов комбинаций НУК(1;2;3 мг/л) и БАП (0,1;1;2;3;4;5 мг/л) и 8 вариантов комбинаций 2,4Д (0,5;1;3;5 мг/л) и БА11 (1;5мг/л). Интенсивность синтеза антоцианов оценивали визуально по степени покраснения каллуса (точечное покраснение, незначительное покраснение отдельных участков, яркие участки покраснения).
Реакция эксплантов листовых пластинок на средах с ПУК и БАП выражалась в образовании каллусов в областях среза и ветвления жилок. Каллусы различались по размеру и окраске. Экспланты всех сортов винограда имели хорошо различимые каллусы к 20-25 дню с момента эксплантации. Индукцию синтеза антоцианов оценивали в темноте (25-28 день культивирования каллуса) и на свету (через 7 дней после выноса каллуса на свет). По покраснению каллуса сорта проявляли специфичность. Так, например, покраснение каллуса в темноте отмечали только у сорта Гранатовый Магарача. На свету отмечали покраснение каллуса в разной степени у всех генотипов в зависимости от варианта среды. При этом у сорта Гранатовый Магарача были отмечены яркие участки покраснения каллуса на средах с низким содержанием БАП. Следует отметить, что этот сорт имеет окрашенный сок, тогда как у остальных сортов окрашена только кожица ягоды. Можно предположить, что это отличие проявляется и в каллусной культуре. Интенсивное покраснение каллуса у copra Гранатовый Магарача возможно также связано с очень высокой чувствительностью этого сорта на свет.
По результатам визуальной оценки каллусов было отобрано несколько вариантов питательных сред, которые оказались наиболее оптимальными для индукции синтеза антоцианов. Антоциановые профили каллуса, полученного на этих средах, были также проанализированы с использованием метода HPLS. Результаты хроматографи- ческого анализа каллуса сорта Каберне Совиньон представлены на рисунке 2.
При культивировании каллуса сорта Каберне Совиньон в темноте синтез антоцианов отсутствовал полностью (рис. 2а). После 7 дней культивирования на свету, в каллусе было выявлено четыре профиля моногликозидов антоцианов из пяти, выявленных в ягоде этого же сорта: cyanidin 3-glucoside, petunidin 3-glucoside, paeonidin 3-glucoside, malvidin 3-glucoside. Вероятно, это связано с разной скоростью и порядком синтеза антоцианов в каллусе винограда, и полный спектр, возможно, синтезируется в более поздние сроки [14].
Интенсивность синтеза антоцианов зависела от комбинации регуляторов роста в питательной среде (рис. 26,с). Как видно из рис. 2, интенсивность синтеза моногликозидов антоцианов на среде 3-5 почти в три раза превышала аналогичные показатели на среде 1-5. В некоторых исследованиях показано, что образование антоцианов в условиях in vitro регулируется содержанием фитогормонов в питательной среде и, главным образом, уровнем ауксинов и цитокининов [5, 6, 8]. а)

Антоциановые профили каллусной культуры сорта Каберне Совииьон
Рис. 2. Антоциановые профили каллусной культуры сорта Каберне Совииьон, полученные в разных условиях культивирования: а) культивирование в темноте, среда 1-5; б) культивирование на свету, среда 1-5; с) культивирование на свету, - среда 3-5

Результаты наших исследований подтвердили стимулирующее действие низких концентраций цитокинина в питательной среде на синтез антоцианов. Однако более важным фактором (по результатам наших исследований), влияющим на покраснение каллуса, оказалось наличие освещения. Эти данные согласуются с результатами Ю. Такеда с соавт. [6], отмечавших первостепенное значение света при индукции синтеза антоцианов в каллусной ткани.

Литература

  1. Dooner Н.К., Robbins Т.Р. Genetic and Developmental Control of Anthocyanin Biosyntesis // Annu. Rev. Genet. - 1991. - V. 25. - P. 173-99.
  2. Holton T.A.,Cornish E.C. Genetics and Biochemistry of Anthocyanin Biosynthesis // Plant Cell. - 1995. - V. 7. - P. 1071-1083.
  3. Калинин Ф.Л. Химическая регуляция метаболизма, роста и продуктивности растений // Физиология и биохимия культурных растений. - 1996. - Т. 28. - № 3. - С. 123-140.
  4. Феденко B.C., Черноусова Н.М. Использование накопления антоциана для оценки устойчивости к низким положительным ночным температурам // Межд. конф. Молекулярно-генетические маркеры растений. - Киев. - 1996. - С. 58.
  5. Ozeki Y, Komamine A. Induction of anthocyanin synthesis in relation to embryo- genesis in a carrot suspension culture - a model system for the study of expression and repression of secondary metabolism // Primary and secondary metabolism of plant cell culture. - 1985. - P. 99-106.
  6. Junco Takeda Light-induced synthesis of anthocyanin in carrot cells in suspension II.Elfects of light and 2,4-D on induction and reduction of ensyme activities related to anthocyanin synthesis // J.of experimental botany. - 1990. - 41, № 227. - P. 749-750.
  7. Бутенко P.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. - Москва: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 159 с.
  8. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В. Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - К.: Наукова думка. - 1980. - 488 с.
  9. Зленко В.А. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда // Институт Винограда и Вина «Магарач». - Ялта, 1986. - 53 с.
  10. Беленко Э.Л., Иванченко В.И., Левченко С.В. Исследование качественного и количественного состава биополимеров в ягодах столового винограда // Виноград и вино России. - 1994. - № 2. - С. 23-25.
  11. Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F.Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15. - P. 473-497.
  12. Методы технохимического контроля в виноделии / Под ред. В.Г. Гержико- вой. - Симферополь: Таврида, 2002. - 258 с.
  13. M.Isabel Spranger. A. S. Curvelo-Gareia. 2002.Caracterizatior. des Varieties Vitis Vinifera Selon Lcur Profil Antocyanique. From Book of Abstract "Grape Vines and Wine as reflected by Science", 24-28 June 2002, Bratislava.
  14. Голодрига П.Я., Костик М А., Зленко В.А. Прогнозирование некоторых компонентов качества урожая сортов и сеянцев винограда по каллусной ткани // Физиология и биохимия культурных растений. - 1986. - Т. 18. - № 5. - С. 510-515.

По материалам конференции: Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства, Новочеркасск, 29-30 июня 2005 г. / ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко.

Метки: сорта |
 
< Анализ мирового генофонда винограда и принципы формирования ампелографической коллекции России   Бактериальный рак >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх