Биотехнология производства оздоровленного посадочного материала винограда в Казахстане

УДК 634.8:581.143.6
БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ВИНОГРАДА В КАЗАХСТАНЕ
С.Г. Долгих
ТОО «Казахский НИИ плодоводства и виноградарства», г. Алмагы, Казахстан; Email: Poleikhsvet@mail.ru
Исследования посвящены диагностике вирусных заболеваний винограда, оздоровлению методом культуры тканей и клонального микроразмножения винограда. Начаты исследования по генетическому мониторингу микроклонированных растений винограда методом 1SSR-PCR.
В соответствии с Программой инновационного индустриального развития Казахстана до 2015 года, биотехнология определена как приоритетная область развития экономики государства, главная роль которой заключается в определении перспективных направлений научных исследований в соответствии с первостепенными потребностями сельскохозяйственного производства. При этом важным аспектом является ориентирование прикладных разработок по насыщению рынка конкурентоспособной импортозамещающей биотехнологической продукцией для сельского хозяйства.
Одной из самых выгодных подотраслей сельскохозяйственного производства является виноградарство. Однако площади виноградников в республике по сравнению с 80-ми годами прошлого столетия сократились более чем в два раза [1]. Закладка новых промышленных виноградников высокопродуктивными безвирусными клонами позволит возродить отрасль. Для этого необходимо заложить суперэлитные маточники перспективных сортов, которые в настоящее время в Казахстане отсутствуют. В последнее время ТОО, фермерские хозяйства и арендные коллективы проявляют значительный интерес к высококачественному посадочному материалу перспективных сортов винограда, а перерабатывающая промышленность ощущает острую потребность в местном сырье. Для ускоренного производства посадочного материала новых, востребованных производителем сортов винограда эффективен метод микроклонального размножения in vitro, который пока не имеет себе равных благодаря высокому коэффициенту размножения, возможности круглый год выращивать растения в контролируемых условиях, планировать производство и оперативно реагировать на изменяющийся спрос рынка. Возникла необходимость ускоренного размножения выделившихся по хозяйственно-ценным признакам генотипов винограда биотехнологическими методами и закладка суперэлитных маточников.
Основной целью микроразмножения является производство генетически стабильных растений, что является важным условием для сохранения клональной чистоты. Однако в природе наблюдается сортовая клоновая изменчивость и изменчивость, образуемая в результате случайных микромутаций генома при культивировании тканей растений in vitro. Эти изменения часто наследуются и поэтому являются нежелательными в клональном размножении. Поэтому в последнее время меняется структура разработок по клональному микроразмножению и возрастает внимание к молекулярным технологиям, призванным повысить эффективность генетической реализации с.-х. растений. Это включает применение ДНК технологий. Создание ДНК маркеров успешно используется при ДНК-генотипировании для идентификации сортов и создании практических технологий регистрации и сертификации, важных с.-х. культур, в том числе и винограда [2, 3, 4, 5, 6].
Исходя из этого с 2009 года в лаборатории биотехнологии начаты исследования по генетическому контролю за растениями винограда в процессе длительного микроклонального размножения с целью выпуска сертифицированного высококачественного посадочного материала. Объектами исследований были перспективные, выделившиеся по хозяйственно-ценным признакам востребованные производством шесть сортов винограда: Илийский, Саперави, Алиготе, Алмалы и Береке, выращиваемые на коллекционном участке Помологического сада.
Обследования виноградников на юге и юго-востоке Казахстана, проведенные в 2006-2008 годах, показали наличие ряда вирусных заболеваний, в том числе и патогенных: инфекционный хлороз, прижилковая мозаика, желтая мозаика, окаймление жилок, мраморность и короткоузлие. Оздоровление от вирусной инфекции проводили методом микроклонального размножения.
Нами разработана биотехнология микроклонального размножения винограда in vitro и получения свободного от вирусной и микоплазменной инфекций посадочного материала винограда. Разработанный регламент включает следующие этапы. Визуально отбирали чистосортные высокопродуктивные и внешне здоровые кусты винограда в соответствии с ампелографическими признаками сорта, развитием кустов, характеру плодоношения и качеству урожая. С внешне бессимптомных кустов заготавливали черенки, размером 15-20 см, проводили стратификацию и затем использовали эти черенки для получения вегетативных побегов, апикальные меристемы которых вводили в культуру тканей (март-май). Размер оптимальных эксплантов для размножения винограда составлял 0,5-2,0 мм. Экспланты культивировали на жидкой питательной среде с цитокинином - 6 бензиламинопурин (6БАП). В состав питательной среды входили макро и микросоли по Мурасиге и Скуга, двойное количество хелата железа; витамины: аскорбиновая кислота -1 мг/л, тиамин -10 мг/л, пиридоксин - 5,5 мг/л, никотиновая кислота - 4,5 мг/л, парааминобензойная кислота - 5мг/л, мезоинозит (75мг/л); аминокислоты: глицин (10 мг/л), глутамин (50 мг/л); углеводы: сахароза (30 г/л) и регуляторы роста: цитокинин 6-БАП -1 мг/л.
Перед введением в культуру тканей апексы винограда стерилизовали с помощью триклозана в составе мыла, диоцидом и активным хлором в составе моющего средства.
Последовательная стерилизация почек винограда в период выхода их из состояния покоя триклозаном и диоцидом обеспечивала 100 % исключение контаминации. Хлор был эффективен на 100 % при стерилизации вегетативных зеленых побегов. При культивировании апикальных меристем винограда на жидкой питательной среде через 30 дней они увеличивались в размере до 1-2 см. Их повторно пассировали на жидкую питательную среду и по достижении побегов винограда длины 4 см с 6-8 почками, разрезали на 2-3 микрочеренка с одним-двумя почками и культивировали каждый на свежей питательной среде. Далее пассирование проводили каждые 2 недели и коэффициент размножения составлял 1:20. Клонирование продолжали до 5 пассажей во избежание генетических отклонений. Затем побеги длиной более 1 см укореняли на модифицированной жидкой питательной среде до образования корней. Первые две недели после переноса растений винограда из условий in vitro в условия in vivo создавали повышенную влажность. Лучшее время перевода растений в теплицу март-апрель. Осенью, к концу вегетации, саженцы вырастали до стандартных размеров, после опадения листьев их выкапывали и в холодильнике хранили до посадки в маточник.
Для решения проблемы генетического контроля за растениями винограда в процессе длительного микроклонального размножения нами проработаны теоретически и частично практически вопросы по выделению растительной ДНК с помощью набора NucleoSpin Plant II (Macherey Nagel Gmbh, Germany). Определение концентрации ДНК в растворе спектрофотометрическими методами. Расчет параметров и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) праймеров: Ml - (АСА CAC)3 CCG; M2 - (АСА CAC)3 C(C/T)G; M3 - (GAG AGA)3 A(C/T)C; M4 - (AGA GAG)3 G(C/T)C; M5 - (ATA TAT)3 T; M6 - (CAC)S; M7 - (CAG)5; M8 - (GTG)5; M9 - GAC ACG АСА CGA CAC GAC AC; M10 - (CAC ACA)2 (A/G)G; Ml 1 - (CAC ACA)2 (A/G); M12 - (CAC ACA)2 (A/G)(C/T); M13 - (AGC)4 (С/Т); M14 - GAC AGA CAG АСА GAC A; UBC 840 - (GAG AGA)3 AAY T; UBC855 - (АСА CAC)3 CCY T; UBC868 - (GAA)6; UBC881 - GGG TGG GGT GGG GYG. Разделение продуктов ПЦР в агарозных гелях. Анализ агарозных гелей и составление бинарных матриц наличия/отсутствия ампликонов. Анализ полученных результатов с помощью компьютерных программ PAST, TreeCon и NewHybrids. Установлена достаточная информативность и надежность ISSR маркеров в молекулярно-генетических исследованиях винограда.

Литература

1. Маденов, Э.Д. Состояние и перспективы развития виноградарства в Казах- стане/Э.Д Маденов, Л.В. Береснева // Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Республики Казахстан, Сибири, Монголии и Кыргызстана.- Алматы: Бастау, 2005.-С.103-106.
2. Franks Т., Botta R., Thomas MR. Chimerism in grapevines: implications for cultivar identity, ancestry and genetic improvement. Theor. Appl. Genet. 104:192-199; 2002.
3. Loureiro M.D., Martinez M.C., Boursiquot J.M., This P. Molecular marker analysis of Vitis vinifera Albarino and some similar grapevine cultivars. J.Am. Soc. Hortic.Sci. 123:842-848. 1998.
4. Bowers J.E., DangI G.S., Vignani R., Meredith C.P., Isolation and characterization of new polymorphism simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.). Genome 39:628-633; 1996.
5. Tomas M.K., Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms whenanalysed as sequenced-tagged sites (STSs). Theor. Appl. Genet. 86:985-990; 1993.
6. Bowers J.E., Boursiquot J-M, This P., Chu K., Johansson H., Meredith C.P. Histological genetics parentage of Chardonnay, Camay, and other wine grapes of northeastern France. Science 285:1562-1565; 1999.

По материалам Международной научно-практической конференции "Научно-прикладные аспекты развития виноградарства и виноделия на современном этапе" - Новочеркасск, ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, 2009