Главная >> Статьи >> Эмбриокультура бессемянных сортов для улучшения сортимента винограда

Эмбриокультура бессемянных сортов для улучшения сортимента винограда

Н.В. Берникова ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии
Исследован эмбриогенный потенциал стеноспермокарпических сортов винограда и разработан метод получения жизнеспособных проростков и сеянцев из изолированных семяпочек в культуре in vitro при скрещивании обоих бессемянных родителей.
В сортименте России практически отсутствуют бессемянные сорта винограда. В Государственный реестр селекционных достижений включен лишь сорт Кишмиш черный, районированный с 1959 года в некоторых южных районах Дагестана. Поэтому для нашей страны актуально создание новых бессемянных сортов, имеющих ценные биологические и хозяйственные признаки в сочетании с более коротким периодом вегетации, устойчивостью к морозу и филлоксере.
Ограниченность количества бессемянных сортов винограда объясняется, прежде всего, сложностью их выведения. Бессемянность в гибридном потомстве обычно очень низка, в скрещиваниях бессемянные сорта могут быть использованы только в качестве отцовских форм, семена раносозревающих сортов часто очень плохо всходят. Кроме того, мало изучены генетические факторы и факторы окружающей среды, влияющие на бессемянность.
Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов, облегчают и ускоряют традиционный селекционный процесс. Благодаря успехам биотехнологии, в первую очередь в области культуры ткани, и появлению возможности культивирования зародыша семени в условиях in vitro, открылась перспектива получения жизнеспособного потомства от скрещивания бессемянных сортов между собой с последующим развитием зародышей семени в контролируемых условиях.
Использование методов in vitro для преодоления постзиготической абортивности расширяет возможности селекции на бессемянность, позволяет включить в селекционный процесс стеноспермокарпические сорта и гибриды в качестве материнских форм. Однако многие исследователи указывают на неопределенность в основных параметрах культивирования и чрезвычайно низкий процент получения растений с помощью применяемой технологии культивирования стеноспермокарпических семян винограда.
Очевидна необходимость в поисках путей оптимизации данной технологии, а именно: изучение эмбриогенеза различных сортов с целью предотвращения деградации зародышей стеноспермокарпических сортов и увеличения популяции сеянцев высокой категории бессемянности.
Исходя из этого, была поставлена цель исследований - изучить эмбриогенез стеноспермокарпических сортов винограда и разработать метод получения жизнеспособных проростков и сеянцев из изолированных семяпочек в культуре in vitro. Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и на полевых участках селекционного центра Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко в 1990-1999 гг.
Предметом исследований являлись семяпочки от самоопыления 14 сортов и 30 комбинаций скрещивания между стеноспермокарпическими сортами и гибридными формами винограда V. vinifera и межвидового происхождения различной категории бессемянности. семяпочки извлекали из ягод и культивировали на агаризованной питательной среде Уайта. Ввод в культуру осуществляли в асептических условиях ламинарного бокса.
Сеянцы, развившиеся из зародышей, культивировали в пробирках до состояния 2-3-х настоящих листьев, а после адаптации к нестерильным условиям выращивали по схеме ускорения селекционного процесса.
Непроросшие семяпочки вскрывали под микроскопом с целью определения наличия в них жизнеспособных зародышей, которые с частью эндосперма высаживали на жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга и вновь помещали в контролируемые условия. Проростки, развившиеся из изолированных зародышей, культивировали, как указано выше. В ходе исследований получены следующие результаты:    
Стерилизация семяпочек. Наиболее трудной задачей при вводе в культуру является стерилизация материала. Этот этап подготовки к посеву во многом определяет результативность всего исследования.
С целью выявления наиболее эффективного дезинфектанта для ступенчатой стерилизации семяпочек сравнили применение рас- творов гипохлорита кальция или натрия, азотнокислого серебра и этилового спирта.
Лучшие результаты получены при стерилизации ягод и семяпочек 0,8 %-ным раствором Ag NO3. Количество инфицированных семяпочек составило около 4 % (в зависимости от экспозиции). В вариантах с применением других дезинфицирующих веществ было заражено от 35 до 100 % семяпочек. Таким образом, установлена высокая эффективность применения AgNO3 в качестве стерилизующего агента при вводе в культуру семяпочек винограда.
Сроки изолирования и введения семяпочек в культуру. Мнения ученых о сроках изолирования, т.е. извлечения из ягод, семяпочек для посева их на питательную среду различны. В связи с этим изучали 5 сроков изолирования семяпочек (35, 50, 65, 80 и 100 дней после опыления) с целью выявления оптимальных, обеспечивающих получение наибольшего количества жизнеспособных проростков.
Анализ данных, полученных за годы наблюдений по всем изучаемым гибридным парам, свидетельствует о том, что выбор срока посева семяпочек на питательную среду является специфичным для различных гибридов и определяется генотипом родителей, а также зависит от погодных условий в период цветения.
Наиболее высокий выход сеянцев от скрещивания сортов Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный в 1992 году отмечен при изолировании семяпочек из ягод через 80 дней после опыления. Количество растений, полученных в семье Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская, было неизменным на протяжении трех сроков изолирования, а в результате скрещивания формы 1-15-7-1 с сортом Кишмиш уникальный максимальное количество сеянцев получено из семяпочек, изолированных через 80 и 100 дней после опыления.
В целом существует сильная нелинейная корреляционная зависимость между сроком изолирования семяпочек и выходом сеянцев (г = 0,94). Для увеличения выхода жизнеспособных растений выделение гибридных семяпочек и ввод их в культуру следует осуществлять через 65-100 дней после опыления (с учетом генотипа родительских сортов).
Обоснование сроков изолирования семяпочек. Одним из критериев выбора срока изолирования семяпочек, на наш взгляд, может служить соотношение количества нормальных семян и рудиментов в ягоде.
Начало деградации семяпочек бессемянных сортов отмечено через 30 дней после цветения. При этом у сорта Кишмиш уникальный нормальных семяпочек всегда больше, чем рудиментов, а у сорта Перлет через 50 дней после опыления число рудиментов в ягоде превышает число нормальных семяпочек.
У мягкосемянного сорта Русбол в течение всего периода наблюдений было больше нормальных семяпочек, чем рудиментов. Уменьшение количества нормальных семяпочек происходило у него постепенно в течение 80 дней.
Полученные результаты свидетельствуют о необходимости индивидуального подхода к выбору срока изолирования и посева семяпочек на питательную среду. Учитывая это, «спасение» в культуре in vitro зародышей сортов высокой категории бессемянности (Перлет) следует осуществлять в период до 50 дней с момента опыления, сортов III-IV класса бессемянности (Кишмиш уникальный) - до 80 дней после опыления, сортов типа Русбол - в течение периода созревания и полной зрелости ягод.
Оптимизация состава питательной среды. Успех культивирования клеток тканей и органов в значительной мере зависит от правильного подбора питательной среды. В наших исследованиях отмечены различия между комбинациями скрещивания по отношению к питательной среде. Выход жизнеспособных зародышей Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный на среде Уайта был в 2,5 раза выше, чем на среде Нича, а для гибридной пары Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская разница составила 5,3 раза. Более половины проанализированных семяпочек от скрещивания формы 1-15-7-1 с сортом Восторг на среде Нича содержали зародыши, но ни один из них з дальнейшем не развился, в то время как на среде Уайта все зародыши, обнаруженные в таких же семяпочках, были жизнеспособными.
Таким образом, наши исследования показали, что питательная среда Уайта более предпочтительна для выращивания семяпочек винограда, чем среда Нича (количество развившихся зародышей составило 36,5 % против 11,1 %).
Эмбриогенез при самоопылении стеноспермокарпических сортов винограда. Критерием подбора родительских сортов для проведения дальнейших скрещиваний в наших исследованиях служил уровень эмбриогенеза в семяпочках, полученных от самоопыления этих сортов. Нами доказано, что между параметрами рудиментов и уровнем эмбриогенеза в них существует прямая корреляционная зависимость, величина которой значительно варьирует по годам.
У большинства сортов V. vinifera отмечено угнетение эмбриогенеза. Количество жизнеспособных зародышей от инцухтирования сортов Белградский бессемянный, Таировский розовый, Вига, Перлет, Розовый бисер и Кишмиш лучистый составило 0 - 3,8 %. Уровень эмбриогенеза сортов межвидового происхождения Русбол, Кишмиш новочеркасский, Гибрид № 311 достигал 50-60 %.
Это указывает на перспективность использования в селекции на бессемянность, с последующим культивированием семяпочек в условиях in vitro, сортов межвидового происхождения Кишмиш новочеркасский, Русбол и Гибрид №311.
Эмбриогенез в скрещиваниях между стеноспермокарпическими сортами винограда. При использовании стеноспермокаргшческих генотипов в качестве родительских форм установлены значительные различия между комбинациями скрещивания по уровню эмбриогенеза. Высокие показатели эмбриогенеза (37-45 %) отмечены при опылении сорта Кишмиш ЦГЛ пыльцой сортов Кишмиш уникальный, Коринка русская, Русбол. Количество семяпочек с жизнеспособными зародышами в скрещиваниях форм 1-15-5-7 и 1-15-7-1 с сортами Русбол и Кишмиш уникальный составило 11-18%. Слабый эмбриогенез отмечен в скрещиваниях, где в качестве материнской формы взяты сорта V. vinifera.
О существенном влиянии на эмбриогенез материнской формы свидетельствуют результаты, полученные при изучении скрещиваний бессемянных гибридных форм межвидового происхождения с сортами Русбол и Кишмиш новочеркасский.
При использовании в качестве опылителя сорта Русбол наибольшее количество проростков получено из семяпочек от скрещивания с формой IV -9-4-4 [(СВ 12-375 х Восторг) х Русбол)]. Результативность скрещивания этой формы с сортом Кишмиш новочеркасский была значительно ниже. Использование в качестве материнской формы гибрида 13-7-12-пк малоэффективно независимо от опылителя. Повышение уровня эмбриогенеза обеспечивает проведение насыщающих скрещиваний. В 70 % семяпочек от опыления формы IV-9-4-4 [(СВ 12-375 х Восторг) х Русбол] пыльцой сорта Русбол развились зародыши.
Влияние метеорологических условий на эмбриональное развитие семяпочек. Установлено, что значительное влияние на эмбриогенез оказывают погодные условия. Корреляционный анализ зависимости эмбриогенеза от климатических факторов показал, что наиболее тесная связь (г = 0,69) существует между уровнем эмбриогенеза и суммой активных температур в период за 2 недели до начала цветения (бутонизация) и среднемесячной температурой воздуха в июне, в период оплодотворения и постоплодотворения (г = 0,66). В это время заканчивается формирование генеративных органов виноградного растения, происходит оплодотворение и начинается этап эмбриогенеза (развитие зародыша из зиготы).
Агробиологическая оценка гибридных сеянцев. Практически все полученные сеянцы отличались повышенной зимостойкостью. Распускание глазков после зимы 1993-1994 гг. (абсолютный минимум температуры воздуха минус 26,7 °С) у большинства сеянцев составляло свыше 50,0 %. По срокам распускания почек и дате начала цветения различия не отмечены. Более ранним созреванием ягод отличались сеянцы из семьи Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская.
На фоне ежегодной гибели растений от филлоксеры выделились сеянцы, у которых не наблюдалось торможения роста. Они хорошо восстановились после зимы 1997-1998 гг., когда минимальная температура воздуха опускалась до минус 26,2 °С, и многие сеянцы погибли. Наибольший интерес среди них представляют 2 сеянца: IV-11-7-6 (Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный) и IV-11-4-6 (IV- 9-4-4 х Русбол).
В ходе исследований выделены два сеянца: VI-15-1-2 из семьи Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская, отнесенный к III—IV классу бессемянности (средняя масса семени 17,0 мг, масса самого большого семени 26,9 мг), отличающийся повышенной морозостойкостью, и сеянец из семьи Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный, с ягодой массой 2,3 г и средней массой семени 30 мг (масса самого большого семени 49,7 мг). Средняя масса грозди 140 г.
Эти сеянцы могут служить исходным материалом для дальнейшей селекции с целью получения гибридов высокого класса бессемянности, обладающих повышенной устойчивостью к неблагоприятным условиям окружающей среды.
На основании проведенных исследований, разработан метод получения исходного материала для селекции бессемянных сортов из изолированных семяпочек в культуре in vitro, включающий следующие этапы:

  1. Подбор сортов для скрещивания. В качестве материнской формы рекомендован сорт Кишмиш ЦГЛ, отцовской - Кишмиш уникальный, Коринка русская, Русбол.
  2. Гибридизация по схеме бессемянный сорт х бессемянный.
  3. Выделение гибридных семяпочек через 65-100 дней после опыления, дезинфекция ягод и семяпочек 0,8 %-ным раствором AgN03 с экспозицией 5-10 минут, посев на питательную среду Уайта.
  4. Стратификация семяпочек при температуре воздуха +3+5 °С в течение трех-четырех месяцев.
  5. Осуществление контроля за ходом культивирования: температура воздуха +25+27 °С, шестнадцатичасовой световой день при интенсивности освещения 2-3 тыс. люкс.
  6. Получение проростков и пробирочных растений.
  7. Вегетативное размножение сеянцев методом клонального микроразмножения.
  8. Пересадка сеянцев на субстрат в торфоперегнойные горшочки.
  9. Адаптация к нестерильным условиям.
  10. Высадка растений в открытый грунт.

По материалам научно-практической конференции «Адаптивное ведение виноградарства (селекция, питомниководство, технологии возделывания, виноделие)», г. Новочеркасск, 19-23 апр. 2004 г.

Метки: селекция |
 
< Экстремальные виноградники Земли   Эффективность производства винограда в северной зоне промышленного виноградарства >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх