Использование методов биотехнологии в виноградарстве

Н.П. Дорошенко ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии
Рассматривается современное положение в двух направлениях сельскохозяйственной биотехнологии: в генетической и клеточной инженерии. Приводятся результаты исследований по получению оздоровленного посадочного материала с помощью метода клонального микроразмножения и сохранения генофонда винограда in vitro. Отмечаются перспективные направления создания генетического разнообразия для селекционной работы.
Биотехнология (биологическая технология) включает в себя два, казалось бы, несовместимых понятия - промышленность и биологию. Наиболее всеобъемлюще функцию биотехнологии можно охарактеризовать как целенаправленное превращение материи (и энергии) с помощью организмов.
Термин «биотехнология» впервые использовал венгр Карл Эреки в 1919 г. для обозначения работ, в которых продукты получают с помощью живых организмов. В биологическом энциклопедическом словаре биотехнологией называют использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Европейская Федерация биотехнологии (EFB) определяет современную биотехнологию как использование наук о природе (биологии, химии, физики) и инженерных наук (например электроники) применительно к биоистемам в биоиндустрии, а Европейская комиссия (ЕС) дополняет - для того, чтобы снабдить биологическое сообщество требуемыми продуктами и услугами.
Последние два десятилетия XX века характеризуются выдающимися достижениями в биотехнологии, являющейся междисциплинарной областью знаний, базирующейся на микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, биоорганической химии, биофизике, вирусологии, иммунологии, генетике, инженерных науках и электронике. Применение новых методов и значительные успехи, достигнутые во второй половине XX в фундаментальных исследованиях, создали предпосылки для развития биотехнологии.
Что же такое биотехнология? В свете современных представлений биотехнология растений - это соединение методов культуры клеток и тканей растений с методами молекулярной биологии и техникой рекомбинантных ДНК [1].
Культивируемые клетки и ткани высших растений обладаю] рядом уникальных особенностей, отличающих их от клеток животных и микроорганизмов, что и позволяет их широко использовать. Во- первых, их можно выращивать в виде неорганизованной клеточной массы (каллус), способной к синтезу видоспецифичных хозяйственно важных соединений, и заменять ими растительное сырье, получаемое от растений in vivo. Во-вторых, по желанию экспериментатора можно с помощью нехитрых манипуляций заставить изолированные клетки образовывать растения - регенеранты. Выбирая в качестве объекта интегрированную систему (зародыши, апикальную меристему, пазушные почки), можно клонировать растения, т.е. получать растения, идентичные исходному. Если же в качестве объекта использовать изолированные клетки или протопласты, то в этом случае с большой вероятностью возникнут измененные варианты, что создает разнообразие для селекционера.

Что может дать биотехнология сельскому хозяйству?

Все новые клеточные технологии можно разделить на две группы: I - ускоряющие и облегчающие традиционный процесс сельского хозяйства; II - создающие генетическое разнообразие и позволяющие путем селекции на уровне соматических клеток проводить скрининг генотипов с важными сельскохозяйственными признаками [2]:

Биотехнология объединяет два направления: клеточную и генетическую инженерию. Из сказанного выше ясно, что в процессе культивирования можно осуществлять различные манипуляции с клетками и получать растения с новыми наследственными свойствами. Поэтому это направление получило название «клеточная инженерия». Генетическая инженерия - наука более молодая, датой ее рождения считают 1972 год, когда была создана первая химерная молекула ДНК. Зарождение генетической инженерии уходит корнями в развитие молекулярной генетики, биохимии.
Применительно к сельскохозяйственной биотехнологии с помощью методов генетической инженерии может и должна быть решена задача по созданию новых и улучшенных генотипов растений и животных с комплексной устойчивостью к наиболее опасным патогенам и другим вредным организмам, к абиотическим факторам среды.
Эти технологии, вне всякого сомнения, прогрессивны, однако их биологическая безопасность до сих пор недостаточно исследована и представляет опасность для всего живого на Земле. В ведущих западных державах осуществляется жесткий контроль над внедрением
трансгенных растений в растениеводство, так как они несут в агроценоз новые биологические риски, которые могут отрицательно влиять на растения, животных и организм человека. В России также, как и в других странах, принят закон «О государственном регулировании генно-инженерной деятельности».
Во всем мире проявляется противодействие генетически модифицированным продуктам питания (ГМП). Сторонники сельскохозяйственной биотехнологии рассматривают ее как ключ к дальнейшему развитию системы ведения сельского хозяйства, обеспечивающей усиление безопасности качества продовольствия в сравнении с современными системами, базирующимися на интенсивном применении химических продуктов. Критики же рассматривают производство ГМП как угрозу биологическому разнообразию растений и выживаемости фермеров.
Быстрыми темпами происходит развитие сельскохозяйственной биотехнологии в США. Проведено 400 полевых испытаний трансгенных вирусоустойчивых растений. При этом отсутствовали сообщения о негативном их воздействии на окружающую среду. Приведены данные по полевым испытаниям вирусоустойчивых генотипов свеклы, огурца, винограда, дыни, овса, папайи, гороха, перца сладкого, картофеля, малины, сои, табака, томата, арбуза, пшеницы с указанием генов и донора устойчивости к вирусам. Получено разрешение федеральных властей США на выращивание в производственных условиях ряда трансгенных фенотипов этих культур.
На V Международном симпозиуме рассматривались вопросы сельскохозяйственной биотехнологии и внедрения в производство генетически модифицированных микроорганизмов в Великобритании, в странах Центральной и Восточной Европы, Мексике, в Китае, Японии.
В статье R. Gotz [3] рассматривается положение с генной инженерией в виноградарстве и ее перспективы на будущее. Отмечается, что противовирусной устойчивостью винограда занимаются рабочие группы в Германии, Франции, Австрии, Швейцарии, Италии и США. Преимущество генной инженерии над классической селекцией состоит в большей целенаправленности и быстроте, а также меньшей затратности и большом наборе генов для манипулирования. Ведутся также работы по противогрибной устойчивости винограда с применением генной инженерии.
Клеточная инженерия - одно из более важных направлений в биотехнологии. Она основана на использовании принципиально нового объекта - изолированной культуры клеток или тканей (выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях), а также на тотипотентности - уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач.
Бурное развитие клеточной инженерии приходится на 50-е годы прошлого века, хотя первые попытки выращивания изолированных кусочков ткани были сделаны гораздо раньше. Настоящее развитие метода культуры и клеток высших растений началось в 1932 году с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф. Уайта.
Пионерами в культуре тканей винограда можно считать французских исследователей G.Morel, L.Fallot, R. Galzu.
G. Morel первый стал культивировать стеблевую ткань винограда in vitro [4]. В дальнейшем исследования в области изолированных тканей и органов винограда развивались быстрыми темпами. Обзор научных сообщений по культуре органов, тканей и клеток винограда in vitro, сделанный А.И. Литваком и А.П. Кузьменко [5], показал широкие потенциальные возможности метода. Сегодня можно с уверенностью заключить, что методы культуры органов, тканей и клеток in vitro занимают прочное место в арсенале средств, определяющих значительный прогресс в селекции винограда и в деле производства посадочного материала этой древнейшей и широко распространенной культуры.
В 1978 году приступили к исследованиям по культуре тканей (по инициативе Н.И. Гузуна) в отделе селекции и генетики МолдНИИ виноградарства и виноделия НПО «Виерул».
Во ВНИИВиВ «Магарач», в связи с острой проблемой ускоренного размножения новых сортов и клонов винограда, устойчивых к болезням и вредителям, ранних сроков созревания, была разработана технология ускоренного размножения винограда с использованием культуры изолированной ткани [6].
В Чечено-Ингушетии также была создана лаборатория клонального микроразмножения, которая осуществляла практическое размножение перспективных сортов винограда.
По инициативе И.А. Кострикина и Б.А. Музыченко в 1983 году приступили к исследованиям по культуре тканей во Всероссийском НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И.Потапенко в лаборатории физиологии и биохимии растений, которая затем была реорганизована в лабораторию биотехнологии.
В лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко в 2004 г. исследования проводятся по следующим направлениям: клональное микроразмножение перспективных сортов винограда; оздоровление посадочного материала от вирусов, микоплазм, бактериального рака; нетрадиционная селекция на бессемянность; создание коллекций генофонда винограда in vitro; изучение анатомо- физиологических особенностей привойно-подвойных комбинаций и разработка методов оценки аффинитета in vitro.
Клоналъное микроразмножение - это принципиально новый метод вегетативного размножения, основанный на получении в условиях in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения. Имея качественные материалы, высокотехнологическое оборудование и инструментарий, можно получать коэффициент размножения 1:20000- 60000 за 8-10 месяцев. На практике реальный коэффициент размножения достигает несколько тысяч.
Метод клонального микроразмножения имеет большое значение для оздоровления исходного растительного материала. Общеизвестно, что борьба с вирусными болезнями многих сельскохозяйственных культур - одна из наиболее актуальных проблем растениеводства во всем мире, так как из производства могут выпадать ценные сорта растений. Особенно остро эта проблема стоит для вегетативно размножающихся культур.
Вирусные болезни винограда постоянно снижают количество и качество урожая и являются одной из причин ранней изреженности виноградников. Часто встречается на виноградниках и наносит им значительный ущерб бактериальный рак.
Вирусные и бактериальные болезни винограда являются хроническими и системными, поэтому вегетативное потомство больны4 кустов оказывается зараженным. Наиболее опасна для размножения - возможность латентного периода развития этих заболеваний, когда растения несут возбудителей без внешних симптомов проявления болезни. Заготовка лозы для размножения от таких кустов приводит к выращиванию больных саженцев.
Основной способ защиты от вирусов - использование привентивных мер. Это получение здорового посадочного материала и предохранение его от вторичного заражения.
Существует несколько путей получения здорового посадочного материала. Первый путь: отбор здоровых кустов. Он состоит из визуального отбора кустов, провокационного теста на прижилковую мозаику, предварительного и основного тестирования. Предварительное тестирование осуществляют с помощью травянистых индикаторов, ELISA-тест или PCR-анализа. Окончательное тестирование растений, которые были тестированы указанными способами и дали отрицательную реакцию, осуществляют на сортах индикаторах.
Протестированный на вирусы растительный материал - это материал достоверно свободен только от определенных, наиболее распространенных и опасных вирусов или вирусоподобных патогенов, которые в естественных условиях присутствуют на виноградных насаждениях РФ.
Импортируемый материал также должен быть проверен на наличие всех вирусов, которые в естественных условиях присутствуют на винограде не только на территории РФ, но и за ее пределами. Этот материал должен быть также свободен от ряда других опасных трудноискоренимых вредителей и болезней. Зачастую при ввозе посадочного материала завозятся сорта, не адаптированные к условиям районов виноградарства РФ и не входящие в Государственный реестр, что приводит к гибели уже заложенных виноградников.

Семенное размножение.

Выявлено, что виноград передает вирусы потомству при семенном размножении, и сорта постепенно отягощаются грузом вирусных инфекций. Так У. Хьюитт [7] отмечает, что передающиеся через почву вирусы обладают очень сходными физическими свойствами, сходны морфологически и многие из них передаются семенами. Вирус короткоузлия обнаружен в оболочке семян и пыльце [8]. Учеными также установлено, что семенами винограда Передается вирус кольцевой пятнистости томата [9], розеточной мо- заики персика [10], болгарский латентный вирус винограда [11], вирус табачной мозаики [12]. Желтая крапчатость винограда передается через пыльцу и семена [13].
Кроме этого, основные сорта винограда характеризуются высоким уровнем гетерозиготности, вследствие чего семенное размножение их с сохранением сортовой чистоты практически невозможно.
При производстве оздоровленного посадочного материала наиболее эффективными признаны приемы, объединенные в систему биотехнологии. Формирование банка здоровых растений осуществляется в результате проведения системы мер оздоровления, включающей внутренний и внешний карантин, тестирование, обеззараживание, размножение «in vitro», адаптацию «in vivo», создание маточников, интегрированную защиту от болезней и вредителей.
Получить посадочный материал, свободный от всех известных вирусов и вирусоподобных заболеваний винограда (Virus free), можно при помощи культуры апикальных меристем при относительном размере выделяемых эксплантов от 0,1 до 0,25 мм (базисный материал класса А).
Меристематические ткани указанного размера вычленяют в асептических условиях под бинокулярным микроскопом при 25-кратном увеличении из почек глазков побегов в период активного роста виноградных кустов или из зимующих глазков и высаживают на питательную среду.
В связи с тем, что регенерационная способность таких эксплантов низкая (не превышает 10,0 %), усовершенствована схема регенерации растений, которая состоит из следующих последовательных этапов:

1. выделение меристем;
2. этап ввода эксплантов в культуру: а) на твердой питательной среде; б) на жидкой питательной среде;
3. этап собственно микроразмножения;
4. этап укоренения;
5. этап микрочеренкования;
6. этап адаптации к нестерильным условиям.

Предлагаемая схема регенерации растений из меристем включает оптимизацию всех этапов клонального микроразмножения от ввода в культуру до микрочеренкования, а также адаптацию оздоровленных растений к нестерильным условиям.
Доказано преимущество питательной среды Мурасиге и Скуга в сравнении со средой Готре и Хеллера. На различных этапах регенерации и клонального микроразмножения растений винограда необходима ее модификация. При продолжительном культивировании ризо- генная зона и надземная часть пробирочных растений лучше развиваются на модифицированной среде Мурасиге и Скуга с уменьшенным количеством макроэлементов. Уменьшение содержания ИУК в питательной среде до 0,1 мг/л обеспечивает улучшение приживаемости микрочеренков, соотношения между развитием у растений ризогенной зоны и надземной части (коэффициент полярности), образование большего числа листьев, а также лучшее развитие растений при субкультивировании. Для сортов винограда Алан1, Агат донской, Восторг, Ромулус, Русмол возможна замена этой питательной среды на питательную среду Ли и де Фоссарда, которая обеспечивает более интенсивное развитие растений. Это позволяет сократить период подготовки к адаптации до 30 дней, а повторное микрочеренкование проводить через 45 дней.
Уточнено содержание цитокинина 6-БАП на каждом этапе культивирования, изучена возможность применения препаратов Bi и Б2, разработан способ повышения регенерационной способности меристем воздействием на них электромагнитным облучением низкой интенсивности (СВЧ-лучи) в комплексе с узкополосным лазером, доказана перспективность применения растительной добавки из тонко- размолотых семян винограда и нового фиторегулятора эмистим.
Установлено, что оптимальное содержание 6-БАП в питательной среде на первом и втором этапах ввода меристем в культуру для большинства сортов составляет 1,0 мг/л.
Эффективность препаратов Б1 и Б2 носит избирательный характер в зависимости от сортовых особенностей. Улучшение репаративной и продуктивной регенерации меристем при введении их в питательную среду было наиболее эффективным для сортов Сибирьковый и Русбол, менее эффективным для сортов Фиолетовый ранний и Ру- пестрис дю Лo, что не позволяет рекомендовать их к широкому применению.
Доказано, что комплексное воздействие СВЧ-лучей и лазера способствует ускоренному прохождению фаз развития меристем, увеличению размерных характеристик, снижает гибель их из-за нек- роза тканей и, в результате этого, обеспечивает повышение регенерационной способности меристем в 5,5 раза.
При добавлении в питательную среду препарата эмистим, благодаря его широкому спектру действия, происходит улучшение приживаемости меристем на обоих этапах ввода. Улучшается пролиферация: новообразование узлов и побегов, срезка побегов для укорене ния и дальнейшего микроразмножения. Так, у сорта Дружба приживаемость меристем на первом этапе возросла с 56,1 до 81,2 % , на втором этапе с 39,0 до 46,8 %, продуктивная регенерация возросла в 3,5 раза.
Оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования пробирочных растений способствует применение СВЧ- лучей, растительной добавки из тонкоразмолотых семян винограда, введение в питательную среду 6-БАП. Под воздействием СВЧ-лучей увеличивается суточная скорость роста в 1,7-2,4 раза, масса растений в 2 раза, длина побега в 1,7 раза, число образовавшихся узлов в 1,2-1,5 раза. При добавлении в питательную среду естественных стимуляторов роста из семян винограда эффективность клонального микроразмножения увеличивается на 27,4 %.
В процессе проведения исследований разработаны способы, направленные на улучшение регенерации растений: стерилизация исходных эксплантов, борьба с хронической инфекцией, оптимизация питательных сред, повышение регенерационной способности меристем из зимующих почек, оптимизация этапа собственно микроразмножения у труднопролиферирующих сортов винограда, адаптациия растений к нестерильным условиям.
Разработан метод водной терапии вызревших микрочеренков с последующей культурой апикальных меристем для комплексного оздоровления растений от вирусов, вирусоподобных заболеваний и микоплазм. Уточнены режимы обработки, обеспечивающие приживаемость, продуктивную регенерацию и оздоровление для целого ряда сортов винограда: Степняк, Саперави северный, Цветочный, Фиолетовый ранний, Душистый, Московский устойчивый.
Результаты изучения фитогормона эмистим указывают на то, что этот препарат положительно влияет на рост меристематических тканей, процессы роста пробирочных растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов, повышает устойчивость к патогенам. Производственная проверка, проведенная на сорте Каберне северный, показала, что благодаря эмистиму улучшается адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям до 95-100 %.
Таким образом, разработаны способы повышения регенерационной способности меристем и, следовательно, эффективности оздоровления растений винограда от вирусной инфекции, которая подтверждена тестированием на травянистых индикаторах и при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Способ адаптации оздоровленных пробирочных растений винограда к нестерильным условиям включает выбор субстрата, отбор растений определенных размеров, обработку растений и субстратов, осуществление процесса адаптации на стеллажах ускоренного размножения растений (СУВР).
Базисные маточники из оздоровленного посадочного материала могут быть заложены на участках, удаленных от рядовых насаждений винограда на расстояние не менее 1000 м. Во избежание вторичного заражения, оздоровленные растения высаживают в почву, свободную от нематод - переносчиков вирусов и возбудителя бактериального рака. Таковыми считаются почвы, на которых в течение 10-12 лет не выращивался виноград, а последние 3-5 лет выращивались зерновые культуры.

Разработаны следующие способы закладки маточника:

1. высадка растений в пленочную теплицу на постоянное место по схеме посадки 1,5-2,0 м х 0,4 м, с последующим содержанием маточника под пленкой или вегетированием растений на открытом воздухе;
2. высадка растений в пленочную теплицу по схеме 40 х 30 см с последующей выкопкой полученных саженцев, хранением их и высадкой в открытый фунт;
3. закладка маточников в стационарной теплице осуществляется в два этапа:в первый год растения, полученные in vitro , высаживают по уплотненной схеме (30 х 15 см) в теплице или в открытом грунте, а затем пересаживают в теплицу по схеме 90 х 90 см и при обрезке на одно-двухглазковые рожки оставляют три побега;
4. высадка растений в открытый грунт с предварительной их закалкой.

Разработанная технология закладки маточников из оздоровленного посадочного материала проверена в пленочных, стационарных теплицах и в открытом грунте в ряде виноградарских хозяйств Дона. Доказана возможность и достаточно высокая эффективность этого пути создания сортовых маточников базисного посадочного материала.
В настоящее время начата работа по созданию современного питомниководческого центра на песчаных землях Ростовской области (Нижне-Кундрюческом отделении опытного поля) для производства отечественного сертифицированного посадочного материала, свободного от хронических болезней и карантинного вредителя филлоксеры.

Создание коллекций генофонда винограда in vitro.

Приоритетным направлением адаптивной селекции XXI века является сохранение естественного генетического разнообразия растений. Идеальной альтернативой или дополнением к полевой коллекции является хранение винограда in vitro, в виде растущих коллекций периодически субклонирумых растений.
В обычных культуральных условиях хранение in vitro является трудоемким процессом, так как требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через 2-2,5 месяца, что требует больших трудовых и финансовых затрат. Необходимо было разработать такие способы хранения, чтобы изменить кинетику роста растений и увеличить временной интервал между пересадками. Для этого разрабатывались способы хранения при пониженной положительной температуре и освещенности, с применением ростовых и осмотических ингибиторов, природных регуляторов роста.
В результате этого нами предложены новые условия продолжительного хранения генофонда винограда: до 10-12 месяцев и более без пересадок за счет использования питательной среды Мурасиге и Скуга, модифицированной для хранения, температуры 4 °С и освещенности 0,3-0,5 тыс. люкс.
Впервые осуществлено применение природных ингибиторов для депонирования растений винограда. Добавление в питательную среду семян винограда в повышенных концентрациях (1,0% порошок тонкоразмолотых семян или 20 % водная вытяжка) создает в ней такой уровень естественных ингибиторов, при котором наблюдается снижение ростовых процессов и можно в 4-5 раз увеличить промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду.

Разработана технология создания генофонда винограда in vitro, которая включает:

1. отбор исходного материала на виноградных кустах без признаков вирусных и бактериальных болезней;
2. ввод в культуру эксплантов размером до 0,1 мм для оздоровления от латентных вирусов;
3. регенерация из них растений и микроразмножение;
4. тестирование на наличие вирусов;
5. культивирование оздоровленных растений при пониженной положительной температуре, при добавлении в питательную среду ростового, осмотического или природного ингибитора;
6. ежемесячный контроль над ходом хранения растений и по мере необходимости пересадка растений на свежую питательную среду.

Перечень возможных, но находящихся еще на разных этапах разработки биотехнологических методов очень большой. Сравнительно хорошо продвинулись исследования, призванные сделать общедоступным способ получения регенерангов из каллуса. В процессе получения эмбрионов и регенерантов из каллусной ткани можно воздействовать на формирующийся организм посредством изменения компонентов среды. Применение селективных сред позволяет уже на стадии каллусной ткани или суспензионной культуры отбирать клетки, устойчивые к повышенному содержанию солей или гербицидов, толерантные к грибным, бактериальным токсинам или самим патогенам.
Большой интерес вызывают технологии получения гаплоидных организмов через культуру пыльников, когда регенерация побегов происходит из гаплоидной спорогенной ткани.
Метод in vitro позволяет проводить искусственное заражение и оценивать резистентность сеянцев на ограниченном количестве материала без риска потерять исходный образец.
Метод микроклонального размножения может быть использован в физиологических, биохимических, фитопатологических исследованиях сельскохозяйственных растений. Метаболические процессы, связанные с синтезом белков, жиров, углеводов, аминокислот и т.д., а также механизмы, обеспечивающие устойчивость растений к болезням и насекомым вредителям, могут быть изучены полнее и точнее при использовании линий с одинаковой генетической основой.
Таким образом, можно утверждать, что метод микроклонального размножения будет играть важную роль не только в клеточной инженерии, но и в практической реализации основных направлений генетической инженерии в растениеводстве.

Литература

1. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология га их основе. - М., 1999.
3. Gotz. R. Rosige Zeiten oder der Volf in Schafspelz? // Dtsch.Weinmag.-2001. - № l.-C. 18-19.
4. Morel G., Martin C. Guerison de Dahlaias attents d'une maladie a virus.//Acad. Sci.-1952/-235/21.
5. Литвак А.И., Кузьменко А.П. Культура клеток, тканей и органов винограда in \Иго.//Селекция устойчивых сортов винограда. - Кишинев, 1982. - С. 116-139.
6. Голодрига П.Я., Зленко В. А. и др. Методические рекомендации по клональ- ному микроразмножению винограда. - Ялта, 1986.
7. Хьюитт У. Вирусные и вирусоподобные болезни винограда // Вирусные болезни ягодных культур и винограда. - М, 1975. - С. 264-266.
8. Cory L., Hewitt W.B.-Phytopath.,1968,58,1316-1320.
9. Uyemoto J.K.-P1. Dis. Report., 1975, 59, 98-101.
10. Allen W.R., Van Schagen J.G., Eveleigh E.S. - Can. J. Plant Pathol, 1982.
11. Uyemoto J.K., Tascbenberg E.F., Hammer D.K. - PI. Dis. Report, 1977, 61, 949-953.
12. Gilmer E.M., KeltsL.J. Phytopath., 1968, 58, 3, 277-278.
13. Woodham R.C., Krake L.R. Vitis., 1982, 21, 337-345.

По материалам научно-практической конференции «Адаптивное ведение виноградарства (селекция, питомниководство, технологии возделывания, виноделие», г. Новочеркасск, 19-23 апр. 2004 г.