Главная >> Статьи >> Молекулярные аспекты оценки сортов и диких форм винограда и сохранение их в условиях in vitro

Молекулярные аспекты оценки сортов и диких форм винограда и сохранение их в условиях in vitro

УДК 634.84:577.21:57.085.2

В.П. Рисованная, С.М. Гориславец,
Лаборатория молекулярно-генетических исследовании Национального института винограда и вина «Магарач». Украина, г. Ялта;

Roberto Bacilieri
Institut national de la recherche agronomique. Centre INRA de Montpellier 2 Place Viala, 34000 Montpellier. France

Образцы селекционных сортов и диких форм проанализированы методом SSR-ПЦР анализа с целью идентификации, паспортизации и оценки происхождения. По полиморфным молекулярным маркерам оценена стабильность генотипов при длительном культивировании в коллекции in vitro.

На первом рабочем совещании по проекту ЕС GrapeGen06 был представлен рабочий пакет по созданию длительной стратегии рационального использования генофонда винограда, обмена и хранения его в масштабах национальных и европейских уровней. Основой для решения этих проблем является идентификация и анализ генетических ресурсов винограда [1].

В настоящее время с этой целью в мире широко применяются молекулярные методы анализа, позволяющие более точно дифференцировать генотипы. Одним из наиболее информативных методов изучения генетического разнообразия растений на молекулярном уровне считается метод анализа ДНК с использованием микросателлитных маркеров. Вследствие своей кодоминантности. высокой информативности и простоты оценки микросателлиты являются идеальными молекулярными маркерами для генотипирования сортов [2]. Применение этого метода для изучения винограда, в дополнение к его ампелографическим характеристикам, позволяет более точно идентифицировать сорта, оценивать их происхождение и дифференциацию, реконструировать родословную, выявлять синонимы и примеси на коллекции [3]. В предлагаемой статье представлены примеры изучения культурных и диких форм винограда по молекулярным маркерам.

Исследования проводились в рамках международного проекта ECO-NET «Генетические ресурсы культурного и дикого винограда: идентификация, описание, оценка и использование старых сортов и диких генотипов» на базе Института сельскохозяйственных исследований (INRA, Montpellier, Франция).

Материалы и методы  Растительный материал.

В качестве материала для исследований использованы образцы сортов культурного винограда (селекционные, аборигенные) и дикие формы рода Vitis L. Амплификация экстрагированной ДНК винограда была выполнена в реакционной смеси с использованием микросателлитных праймеров, рекомендованных Европейской базой данных и проектом GrapeGen06, с помощью ПЦР-анализа. Генотипирование сортов проводилось по 6-22 микросателлитным профилям ядерной ДНК (пДНК) и 3 хлоропластной (срДНК) на базе 1NRA на автоматическом секвенаторе АВ1 Prism 3130XL (Applied Biosystems). Для оценки результатов секвенирования использовали программу Gene Map 3.5.

Результаты и обсуждения

Оценка наследования и/или происхождения гибридных сортов и форм винограда является одной из важных задач селекционного процесса. Для анализа отношений родитель - потомок были отобраны селекционные сорта технического направления использования: Рубиновый Магарача, Рубин Голодриги, Антей магарачский и Гранатовый Магарача, характеризующиеся групповой устойчивостью к болезням и вредителям, а также их родительские формы (рис.1). Эти сорта имеют межвидовое происхождение, поскольку среди их родительских форм, кроме сортов Каберне-Совиньон и Саперави, на разных этапах селекционного процесса были использованы сложные межвидовые гибриды, такие как Сейв Виллар 20347, Магарач 6-68-27, Магарач 85-64-16 и др. На первом этапе анализ, проведенный по 6 микросателитным локусам: VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, ssr VrZAG62 и ssr VrZAG79, подтвердил отношение родитель - потомок для сорта Рубиновый Магарача. Однако этого количества локусов оказалось недостаточно для оценки отношения у других сортов, которые являются близкими по происхождению.
Схема скрещивания, в результате которой были получены селекционные сорта
Рис.1. Схема скрещивания, в результате которой были получены селекционные сорта. Жирным шрифтом выделены сорта, которые были включены в эксперимент, остальные родительские формы отсутствуют

Поэтому спектр микросателлитных локусов в целом был увеличен до 22-х ядерных и 3-х хлоропластных. Особенность хлоропластных гаплотипов заключается в том, что они наследуются по материнской линии. Это позволило установить, что сорта Антей магарачский и Рубин Голодриги наследуют гаплотип D (107/104/115) и 50 % аллелей микросателлитных локусов от материнского сорта Рубиновый Магарача. Отцовские формы Магарач 85-64-16 и Магарач 6-68-27 отсутствуют, при этом общая доля аллелей микросателлитных локусов в генотипах сорта Антей магарачский и Сейв Виллар 20347 составляет 50 % (табл. 1).

Таблица 1
Пример микросателлитных профилей пДНК селекционных сортов и их родителей.
Размеры ПЦР-фрагментов указаны в парах нуклиотидов


Сорт

Аллели микросателлитных локусов, размеры в п.н.

Win 16

VVIq52

VVlv37

VVMD27

VVS2

ZAG79

Каберне Совиньон

151/151

77/83

159/159

172/186

137/149

248/248

Рубиновый Магарача

149/151

79/83

149/159

186/186

131/149

248/262

Саперави

149/151

77/79

149/149

186/186

131/143

244/262

Рубин Голодриги

147/149

79/83

149/155

186/191

131/131

246/248

Антей магарачский

147/151

79/79

149/159

176/186

131/143

248/256

Гранатовый Магарача

147/151

79/79

149/159

176/178

131/131

244/256

Сейв Вилар 20347

147/155

79/81

147/159

186/186

143/147

256/262

Каберне Совиньон

151/151

77/83

159/159

172/186

137/149

248/248

Таким образом, вопрос об отцовской форме сорта Антей магарачский требует дальнейшего изучения. Сорт Рубиновый Магарача наследует гаплотип D от своего материнского сорта Каберне-Совиньон. Генотип сорта Гранатовый Магарача несёт 50 % общих аллелей с отцовским сортом. Два его образца, имеющиеся на коллекции, проанализированы по локусам: VVIb 01, Win 16, WMD24, WMD32, WMD5, ZAG62 и ZAG79. Было установлено, что генотипы этих образцов имеют в каждом локусе одну общую аллель в т.ч. и с отцовским сортом Антей магарачский. Наличие общего аллеля в каждом локусе свидетельствует о родственных отношениях этих образцов. Вероятно, они были получены вследствие вегетативного размножения двух разных сеянцев от одного скрещивания. Это согласуется с результатами анализа образцов по хлоропластным локусам ССМРЗ, ССМР5, ССМР10. Оба образца сорта Гранатового Магарача имели одинаковый гаплотип А (106/105/114), что возможно при наличии общей материнской формы.

Молекулярио-генетические паспорта или коды сортов винограда. На основе микросателлитных профилей получены уникальные «молекулярно-генетические паспорта» или коды сортов, примеры которых представлены в табл. 2; идентифицированы некоторые синонимы; создана база генетических профилей сортов винограда (база генетического сходства/различия).

Таблица 2
Коды сортов по микросателлитным локусам в соответствии с требованиями Европейской базы данных винограда


Сорт

Генетические коды по микросателлитным локусам

VVMD5

VVMD7

VVMD27

VVS2

VrZAG62

Каберне Совиньон

TR1 CF2

СП СП

CS1 CS2

CF1 SI1

CH1CF1

Мускат Александрийский

MU1TR1

MU2 FE2

MU1 MU2

ВА1 99R2

MU1 CF2

Султанина

CHI СН1

СП SU2

СП MU2

SU1 SI1

CHI CHI

Стабильность генотипов винограда в разных экологических зонах и при длительном культивировании в условиях in vitro. Оценкой стабильности и стандартизацией результатов молекулярно-генетического профилирования сортов винограда занимается ряд европейских лабораторий, в том числе и в рамках проекта GrapeGen06. Нами были проанализированы по 22 ядерным микросателлитным локусам образцы некоторых сортов винограда, сохраняющиеся на ампелографической коллекции НИВиВ «Магарач» и коллекции Вассал (Франция). Сравнительный анализ полученных микросателлитных профилей установил, что, например, генотипы образцов Каберне-Совиньон и Кишмиш чёрный идентичны.

В связи с угрозой сокращения генетического разнообразия ресурсов винограда большое значение имеет размножение, сохранение и, следовательно, длительное культивирование ценных генотипов в условиях in vitro. Современные технологии получения посадочного материала винограда методами in vitro предполагают контроль стабильности генома при длительном культивировании. Образцы сортов Гранатовый Магарача, Рубин Голодриги, Рубиновый Магарача и Антей магарачский поддерживаются микрочеренкованием в коллекции in vitro более 10 лет.
Сравнительный анализ генотипов этих образцов и исходных сортов, растущих на коллекции, был проведен по микросателлитным локусам: VVlnl6, VVIp60, VVIv67, VVMD21,VVMD27,VVMD28. Полученные результаты показали стабильность их аллельного состава независимо от длительности культивирования.
Изучение генома дикого винограда актуально как для селекции, так и для решения вопросов происхождения культурного винограда. В настоящее время в горных заповедных зонах Крыма еще существуют очаги естественного произрастания дикого винограда. Образцы, обнаруженные в долине реки Учан-Су (Алушта), а также в районе «большой Ялты», были проанализированы методом SSR-ПЦР по 20 микросателлитным локусам. Полученные результаты анализируются.

Источник: Мобилизация и сохранение генетических ресурсов винограда, совершенствование методов селекционного процесса: сборник научных статей / ГНУ Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии. - Новочеркасск: Издательство ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, 2008.

Литература:
1. Patrice This. Minutes of the First GrapeGen06 Workshop March 2nd and 23rd, 2007 Presidence's building 1NRA, Versailles (France). 15pp.
2. Sefc KM, Lefort F, Grando MS, Scott K, Steinkellner H and Thomas MR. Microsatellite markers for grapevine: a state of the art, 433-463. In: Molecular biology and biotechnology of grapevine. Kluvver Publishers. Amsterdam.- 2001 .-499 p.
3. Lefort F.. Gorislavets S., Risovannaya V., Troshin L. Genetic Profiling Of Moldavian, Crimean and Russian Cultivars of Vitis vinifera L. with nuclear microsatellite markers // Oenologie. - Paris: Editions Tec & Doc, 2003. - P. 71-73 iz 694 p.

 

Источник: Мобилизация и сохранение генетических ресурсов винограда, совершенствование методов селекционного процесса: сборник научных статей / ГНУ Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии. - Новочеркасск: Издательнство ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, 2008.

Метки: селекция | сорта |
 
< Можно ли бороться с растрескиванием ягод?   Морозоустойчивость генетически разнородного генофонда винограда >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх