Главная >> Статьи >> Повышение регенерационных способностей эксплантов при клональном микроразмножении винограда

Повышение регенерационных способностей эксплантов при клональном микроразмножении винограда

Т.М. Череватая
ННЦ «Институт виноградарства и виноделия им. В.Е.Таирова» УААН, г. Одесса
Приведены результаты исследований по оптимизации процесса клонального микроразмножения для производства посадочного материала винограда. Повышение экономической эффективности технологии достигается применением разработанного способа предварительной подготовки и отбора исходного материала, оптимального типа эксплантов, оптимизированного состава питательных сред и ионитных субстратов, источников света с наиболее благоприятными спектральными характеристиками. Изучение интенсивности размножения клонов винограда in vitro выявило корреляцию с продуктивностью клонов in vivo.
На современном этапе особенно остро стоит задача производства высококачественного посадочного материала высокопродуктивных сортов и клонов винограда. Направленное сортоулучшение, выделение, изучение перспективных клонов, их размножение вносит весомый вклад в произодство сертифицированного посадочного материала. Методы культуры in vitro обеспечивают ускоренное размножение клонов винограда, оздоровленных от вирусной и бактериальной инфекции, и получение базового материала, который является основой производства сертифицированного посадочного материала. Таким образом значительно сокращается процесс внедрения в производство новых сортов и клонов.
Лаборатория культуры in vitro ИВиВ им. В.Е. Таирова функционирует в составе Центра клоновой селекции. Отдел клоповой селекции проводит большую работу по выделению перспективных клонов, их изучению и внедрению. Основным направлением исследований и научно-практической деятельности лаборатории культуры in vitro является изучение особенностей размножения in vitro сортов и клонов винограда и разработка биотехнологии клонального микроразмножения винограда. В нашей работе успешно применяются известные методики микроклонирования [1,2]. Но для производствен- ного ускоренного размножения и получения высококачественного посадочного материала необходимо разработать высокоэффективную технологию с учетом особенностей размножения клонов.
С этой целью проведены исследования по оптимизации этапов клонального микроразмножения, которые позволят создать целостную технологию круглогодичного размножения и производства высококачественного посадочного материала винограда в необходимых объемах. Разработаны приемы повышения регенерационных способностей эксплантов на каждом из этапов размножения in vitro, что в целом ускоряет процесс микроклонирования и способствует увеличению объемов производства.
Установлено, что оптимальным типом исходного материала для клонального микроразмножения винограда являются зеленые побеги кустов, культивируемых в теплице. За состоянием маточных насаждений в тепличных боксах осуществляется санитарный контроль. Лаборатория вирусологии проводит визуальное обследование, а также лабораторное тестирование на скрытое поражение патогенами и предоставляет здоровый материал для размножения in vitro.
Разработан специальный прием обрезки побегов, который стимулирует активный рост пасынков, что позволяет иметь в наличии инициальные эксплангы для введения в стерильную культуру на протяжении длительного периода вегетации. Объединение данного метода с приемом выгонки побегов из вызревшей лозы в зимний период обеспечивает круглогодичное наличие исходного материала для введения в стерильную культуру. Выявлены отличия в развитии инициальных эксплантов in vitro в зависимости от их размера и местоположения на исходном побеге.
Оптимальным типом эксплантов для клонального микроразмножения винограда, проявляющим высокий морфогенетический потенциал, являются одноглазковые микрочеренки размером 0,8-1,0 см, отобранные на уровне 3-4-го узлов исходных побегов. Использование данного типа эксплантов позволяет повысить приживаемость инициальных эксплантов на 18-20 % и сократить сроки развития растений на 2,0-2,3 дня на этапе введения в культуру. Особенности происхождения исходного материала позволяют применять щадящую технику стерилизации. Ступенчатая стерилизация с обработкой 60° этанолом (20 сек.) и применением в качестве стерилизующего агента 2 % раствора гипохлорита кальция (5 мин.) сокращает уровень контаминации до 5-6 % при высоком уровне приживаемости - 85-90 %.
Проведена оптимизация качественного и количественного состава питательной среды для первых стадий культивирования in vitro. Установлена возможность исключения из состава среды синтетических фитогормонов как возможной причины хромосомных нарушений. В результате исследований доказана эффективность введения в состав среды дополнительных источников азота - Са (NO3)2 и смеси аминокислот для активизации роста и развития эксплантов. Это позволило ускорить сроки формирования взрослых микроклонов на 2,3-2,5 дня в каждом пассаже. Развитие микроклонов всех опытных сортов винограда на данной питательной среде проходит без проявления сортовой специфики. Процессы пролиферации и ризогенеза эксплантов проходят сопряженно, что позволяет исключить дополнительные пересадки на среды иного состава.
Изучено влияние спектрального состава света на процессы роста и розвития винограда. Выявлена зависимость особенностей развития микроклонов от соотношения красного и синего света в спектре излучения фитоламп. Установлено, что преобладание красного света (625 нм) до 87,5 % существенно активизирует развитие растений на всех этапах культивирования in vitro и in vivo. Увеличение количества синего света до 25 % улучшает корнеобразование эксплантов при культивировании на агаровых средах и способствует сокращению периода ризогенеза на 1,9-2,2 дня.
На этапах микроразмножения in vitro, адаптации микроклонов и выращивания в теплице доказана целесообразность применения ионитных субстратов. Для клонального микроразмножения винограда in vitro разработан искусственный ионитный питательный субстрат многоразового использования Биона. В результате проведенных исследований определены его оптимальные физико-химические свойства. Наиболее интенсивное развитие растений обеспечивает тип субстрата с рН < 6 и величиной емкости анионита Е = 4,5 мг - экв/г. Применение данного субстрата повышает экономическую эффективность технологии за счет уменьшения затрат на химические реактивы, трудозатрат, сокращения сроков выращивания.
Исследования по определению оптимального типа субстрата для культивирования микроклонов проводили и на этапе адаптации. В качестве субстрата при адаптации и доращивании микроклонов использовали минеральный субстрат на основе цеолита. Субстраты обладают сходными физико-химическими, структурными свойствами и обеспечивают оптимальный тип питания микроклонов путем ионообмена [3]. Преемственность ионитных субстратов при переводе микроклонов из in vitro в условия in vivo способствует быстрой и успешной адаптации корневой системы к новым условиям, повышает приживаемость растений.
Адаптацию проводили путем постепенной подготовки корневой системы и надземной части растений к условиям in vivo. Для этого микрочеренки высаживали на смесь ионитных субстратов Биона : цеолит в соотношении 1:1; 1 :2; 3 : 1. Субстрат объемом 45-50 см3 насыпали в емкости d = 5 см, h= 10 см. После высадки микрочеренков емкости накрывали крышками из фольги и помещали в культуральный бокс. После появления на побеге 2-го листа начинали постепенную адаптацию. Для этого крышки приоткрывали на протяжении 8-10 дней вначале на 1/3 их поверхности, затем на 1/2, 2/3, после чего емкости открывали полностью. Далее переносили растения в вегетационный бокс с температурой 21 -22 °С, влажностью 55-60 %, освещенностью 3,0-3,5 тыс. лк и культивировали непродолжительное время до высадки в теплицу. За этот период благодаря оптимальным размерам емкостей, особому типу субстрата растения формировали более мощные утолщенные побеги и корневую систему; ткани растений обретали способность удерживать воду благодаря формирующемуся восковому эпикутикулярному эпидермису и активизации работы устьичного аппарата. Результаты опытов показали, что самым благоприятным для развития растений является соотношение субстратов 3 : 1 (фракция цеолита - 2,0-3,0 мм). Приживаемость эксплантов на данном субстрате на 32-35 % выше по сравнению с другими вариантами, ризогенез и пролиферация начинаются на 1,8-2,0 дня раньше (таблица 1). Через 10-14 дней растения высаживали на постоянное место для доращивания в тепличные секции в гряды с цеолитовым субстратом (фракция 5-7 мм), соблюдая схему посадки 15 х 15 см. При этом корневая система испытывала минимальные повреждения. Приживаемость была на уровне 97-98 %. К ним применялся комплекс агротехнических мероприятий, принятых в тепличном комплексе Центра клоновой селекции.

Таблица 1
Влияние типа питательного субстрата на развитие микроклонов на этапе адаптации (сорт Каберне Совиньон, среднее за 2002-2004 гг.)


Соотношение Виона: цеолит

Фракция цеолита, мм

Приживаемость,
%

Количество корней, шт.

Длина корней, см

Высота растений через 30 суток

1 : 1

0,5-1,0

27,2

2,0

1,5

2,8

 

2,0-3,0

34,6

2,7

1,9

4,2

 

4,0-5,0

38,1

2,4

1,7

4,0

1 :2

0,5-1,0

31,4

2,3

1,8

3,9

 

2,0-3,0

42,0

2,8

2,2

4,8

 

4,0-5,0

67,3

2,5

2,0

4,5

3 : 1

0,5-1,0

49,4

3,7

3,5

4,6

 

2,0-3,0

93,8

4,3

4,4

6.7

 

4,0-5,0

75,2

4,0

3,9

5,8

Контроль: цеолит

3,0-5,0

23,5

2,9

1,4

4,1

НСР05

 

4,38

0,7

0,63

0,52

Таким образом, адаптацию растений проводили путем сочетания процессов укоренения микрочеренков, выращивания микроклонов с начальным этапом адаптации. Применение данного приема и установление оптимального типа субстрата на этапе адаптации способствуют увеличению жизнеспособности микроклонов, т.е. повышению эффективности данного звена технологии.
Изучение особенностей размножения in vitro клонов винограда проводили по показателям: интенсивность размножения и способность тканей микроклонов опытных клонов к реализации морфогенетического потенциала in vitro. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об отличиях по интенсивности размножения in vitro как между сортами, так и между клонами в пределах сорта. Среди опытных клонов самый высокий коэффициент размножения (за 6 месяцев) выявил клон 441. Менее интенсивно проходит размножение клонов Муската жемчужного и Шардоне, при этом самый высокий коэффициент размножения у клонов 7251 и 4876. В целом клоны привойных сортов размножаются более интенсивно, чем клоны привойных сортов.Самый высокий коэффициент размножения у клонов Бер- ландиери х Рипариа С04 - 1791, Берландиери х Рипариа Кобера 5 ББ - 211161 и Рипариа х Рупестрис 101 -14 - 672 (таблица 2).

Таблица 2
Интенсивность размножения клонов винограда in vitro (2004 г.)


Сорт

Клон

Коэффициент размножения

Мускат жемчужный

8153

1,7- 103

8023

1,8- 10'

7251

2,0- 103

Шардоне

4536

1,3- 103

39303

1,4- 103

4876

1,6- 103

Каберне Совиньон

30251

2,1- 10J

22103

2,3- 10J

441

2,7- 10'

Рх Р 101-14

6114

1,9- 103

672

2,1- 103

4923

1,9- 103

Б х Р С04

2696

2,1- 103

27101

2,6- 103

1791

2,7- 103

БхР Кобера 5 ББ

205131

2,0- 103

21192

2,3- 103

211161

2,5- 103

Изучение интенсивности каллусогенеза и эмбриогенеза тканей подвойных сортов винограда выявило отличия между клонами в пределах сорта (таблица 3). У сорта Р х Р 101-14 самый высокий эмбриогенный потенциал выявил клон 4923. Масса каллусных тканей и количество морфогенных зон существенно превышают эти показатели у клонов 672 и 6114. Среди опытных клонов сорта БхР Кобера 5 ББ наиболее продуктивным является клон 211161, а у сорта БхР С04 - 1791 и 27101.
Таблица 3 -
Продуктивность клонов подвойных сортов винограда в культуре in vitro и в полевых условиях (2004 г.)


Сорт

Клон

Коэффициент размножения

Масса каллуса, г

Количество эмбриогенных зон, шт./см2

Выход черенков с куста, шт.

Рх Р 101 - 14

6114

1,9- 10-

1,674

0,74

14,0

672

2,1- 103

1,898

2,18

14,7

4923

1,9- 103

2,183

2,97

19,1

Бх Р
Кобера 5ББ

205131

2,0- 103

1,952

0,93

37,6

21192

2,3- 103

2,063

2,31

49,2

211161

2,5- 103

2,875

3,08

49,6

Б х Р С04

2696

2,1- 103

1,987

1,58

40,8

27101

2,6- 103

2,968

3,02

39,2

1791

2,7- 103

2,982

3,24

42,8

Сравнительное изучение продуктивности клонов in vitro и in vivo позволило установить корелляцию между изучаемыми показателями. Исследования будут продолжены с целью разработки методики раннего прогнозирования in vitro продуктивности клонов, что представляется важным для сокращения сроков клонового отбора.
Проведенная оптимизация процесса клонального микроразмножения винограда позволила существенно улучшить показатели развития растений на всех этапах культивирования. Разработана высокоэффективная технологическая схема ускоренного размножения in vitro и выращивания посадочного материала винограда. Она базируется на применении сменных ионитных питательных субстратов в сочетании с оптимальными физическими параметрами культивирования с учетом особенностей размножения клонов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения метода in vitro для круглогодичного производства посадочного материала винограда.

Литература

  1. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П.Я. Голодрыга, В.А. Зленко, J1.А. Чекмарев и др. - Ялта, 1986. - 56 с.
  2. Литвак А.И. Размножение винограда в культуре in vitro // Виноградарство и виноделие СССР. - 1982. - № 2. - С. 76-82.
  3. Самсонов A.M., Стыцко С.А. Производство сертифицированного посадочного материала винограда на ионитных субстратах // Виноградарство и виноделие. - Киев: Аграрная наука, 1997. - С. 20-24.
По материалам конференции: Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства, Новочеркасск, 29-30 июня 2005 г. / ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко.
Метки: размножение |
 
< Повышение и сохранение жизнеспособности пыльцы при селекции винограда на бессемянность   Повышение эффективности селекционного процесса при использовании физиологически активных соединений >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх