Главная >> Статьи >> Создание сортов винограда принципиально новой генетической структуры на основе методов биотехнологии

Создание сортов винограда принципиально новой генетической структуры на основе методов биотехнологии

УДК 634.8:631.527:57.085.2
СОЗДАНИЕ СОРТОВ ВИНОГРАДА ПРИНЦИПИАЛЬНО НОВОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ
В. А. Волынкин, Э.Ш. Меметова, В.А. Данилейченко
Институт винограда и вина «Магарач», Украина, г. Ялта
На основе анализа ранее проведенных исследований показывается возможность проведения эффективной гибридизации при скрещивании форм винограда, относящихся к различным видам подрода Euvitis рода Vitis и невозможность получения гибридных форм при скрещивании форм винограда, относящихся к различным родам семейства Vitaceae. Анализируется возможность преодоления этой нескрещиваемости на основе использования метода культуры тканей in vitro и приводятся результаты первых исследований по подбору сред и стадии развития зародышей для возможного получения растений винограда от межродовой гибридизации с использованием метода in vitro.
Развитие физиологии растений, как области знаний, давало основание предполагать возможность использования общих закономерностей в решении частных вопросов сельскохозяйственной практики, в том числе селекции. В полной мере это можно отнести и к научному развитию селекции винограда.
Одним из направлений развития физиологии растений является поиск путей культивирования растений и их органов в искусственных условиях среды в in vitro, что в свою очередь предполагает перевести селекцию с организменного уровня на уровень отдельных органов, а в дальнейшем и на молекулярный уровень.
Однако в настоящий момент селекция винограда, сложного гетерозиготного организма, ведется на основе реализации генеративной гибридизации. Но и при выполнении скрещиваний традиционным методом существует необходимость использования возможности культивирования отдельно взятого зародыша из семени в условиях in vitro. Это связано с тем, что не всегда наблюдается высокая совместимость двух скрещиваемых форм, объясняемая либо низкой фертильностью, либо генетической разнородностью на хромосомном уровне, либо специфичностью развития зародышей некоторых материнских форм, используемых в скрещиваниях. Уже классическим примером может служить получение благодаря использованию культуры тканей in vitro жизнеспособных плодоносящих растений винограда от скрещивания двух бессемянных форм.
Однако существуют и другие проблемы, стоящие перед селекцией винограда, для решения которых необходимо привлекать достижения биологии в области культуры тканей. Одной из таких проблем является получение растений от скрещивания отдаленных с ботанической точки зрения форм винограда. Согласно проведенным нами исследованиям, у винограда успешно осуществляются скрещивания в пределах отдельных видов и на межвидовом уровне в пределах подрода Euvitis рода Vitis. Выполненные во Франции и США экспериментальные работы по подбору пар, в первую очередь по поиску различных материнских форм, позволили получить фертильные растения при скрещивании форм винограда, относящихся к различным подродам рода Vitis - Euvitis (вид Vitis vinifera) х Muscadinia (вид Vitis rotundifolia). При этом следует отметить, что в соответствии с существующими данными, формы этих двух подродов винограда имеют различное количество хромосом.
Переход в селекции винограда от использования исходных форм, относящихся к одному виду, к скрещиваниям отдаленных с точки зрения ботанического и эколого-географического происхождения форм культуры, необходим для получения форм, а в последующем и сортов, которые обладали бы не просто устойчивостью к комплексу патогенов, но которые были бы иммунны к ним.
Одним из направлений формируемой селекционной программы в ИВиВ «Магарач» является получение отдаленных межродовых гибридов винограда на основе использования культуры тканей in vitro.

Эти исследования выполняются впервые, начиная с 2001 года. Ведется подбор скрещиваемых пар, определяются стадии выделения зародыша из семени после оплодотворения, подбираются и модифицируются среды для культивирования зародыша.
Для получения новых сортов винограда, сочетающих в своем генотипе признаки высокого качества урожая с признаками устойчивости к патогенам и абиотическим факторам окружающей среды, большой интерес представляет вовлечение в селекционный процесс сортов, форм различных видов, родов винограда, обладающих огромным генетическим потенциалом.
В свою очередь, совместить признаки различных родительских форм в одном генотипе возможно при благоприятной сочетаемости этих исходных форм. Оценить это возможно по двум параметрам: скрещиваемости исходных форм и наследуемости признаков в потомстве.
Характеру наследования отдельных признаков посвящено достаточно большое количество исследований, в том числе в ИВиВ «Магарач», которые представлены в публикациях [1-3]. Вопросы же скрещиваемости исходных форм, эффективности гибридизации у винограда мало изучены и по этой проблеме мало публикаций [4].
Первоначально, в историческом плане, скрещивания у винограда проводились в пределах вида Vitis vinifera. Взятые в скрещивания сорта легко перекрещивались и селекционеры-виноградари не уделяли внимания различиям в эффективности скрещивая различных сортов этого вида между собой. С возникновением же в виноградарстве филлоксерной проблемы появилась необходимость использовать в скрещиваниях формы винограда из различных очагов происхождения культуры, поскольку в них в результате совместной эволюции патогенов и виноградного растения сформировались формы, обладающие генетически обусловленной устойчивостью к этим патогенам [5, 6]. Соответственно следовало привлекать в скрещивания формы из этих центров, обладающих необходимыми признаками.
Селекция винограда с уровня скрещивания в пределах одного вида перешла на принципиально новый уровень скрещиваний сортов, форм, относящихся к различным видам винограда. Была показана возможность скрещивания форм винограда, относящихся к различным видам подрода Euvitis рода Vitis [7], а позднее и проанализирована эффективность таких различных скрещиваний [8]. С целью получения гибридов винограда от более отдаленных по происхождению исходных форм нами была выполнена гибридизация форм винограда, относящихся к различным родам, но при традиционной генеративной гибридизации получить семена не удалось.
В целом, в биологии у различных культур существует межвидовая и межродовая несовместимость, обусловленная рядом причин, препятствующих нормальному функционированию биологической структуры. У винограда на межвидовом уровне проявления таких закономерностей не обнаружено, но они проявились на межродовом уровне. Одной из причин такого проявления несовместимости является проявление после оплодотворения спустя определенное время так называемой постгамной несовместимости элиминируемых на этапе эмбриогенеза генотипов, при которой несоответствие между развитием зародыша и созреванием перикарпия вызывает неполное формирование эндосперма, в результате чего зародыш погибает [9, 10].
Весьма перспективным при преодолении постгамной несовместимости у растений является метод изолированных зародышей в период раннего эмбриогенеза. Для преодоления межвидовой и межродовой несовместимости с использованием метода in vitro необходимо было определить оптимальные сроки изолирования зародышей и методические аспекты их культивирования.
В эксперименте использованы следующие комбинации скрещиваний:

  1. Vitis cinerea Engelm х Parthenocisus Henryi Graebner;
  2. Vitis Longii Prince x Parthenocisus Henryi Graebner;
  3. Ampelopsis cordata Michx. x Parthenocisus Henryi Graebner;
  4. Vitis cinerea Engelm x Могаби (сорт сложного межвидового происхождения);
  5. Vitis solonis Planch, x Vitis vinifera L. (сорт Королева виноградников);
  6. Vitis vinifera L. (сорт Алиготе) x Vitis rupestris Sheel (сорт Rupestris du Lot);
  7. Vitis amurensis Rupr. x Кентавр магарачский (сорт сложного межвидового происхождения).

Через 20 дней после опыления и каждые последующие 10 дней образовавшиеся ягоды поверхностно стерилизовали 42 % раствором хлорсодержащего препарата (Белизна), в течение 5 минут промывали стерильной водой. В асептических условиях ягоды в течение 5 минут обрабатывали 70 % этанолом, промывали стерильной водой, затем из них выделяли рудименты, семена, которые разделялись на две части. Рудименты и часть семени с эндоспермом и зародышем эксплантировали на жидкую и агаризованную питательные среды с последующим культивированием в темноте при t = 24-27 °С. Были испытаны различные питательные среды:

    1. Шенка и Хильдебранта;
    2. Митчела и Гилдоу;
    3. Нича и Нич;
    4. Модифицированная нами среда Уайта с добавлением NaCl (250 мг/л), СаСЛ (200 мг/л), 6 БАП (2 мг/л), ИУК (0,8 мг/л), гидролизат казеина (500 мг/л), гибберелловой кислоты (4 мг/л) с заменой Ca(N03)2 на NH4N03 (250 мг/л) и Fe2(S04)3 на Fe-хелат по Мурасиге и Скугу;
    5. Соммера, Брауна и Корманика;
    6. Модифицированая среда Мурасиге и Скуга;
    7. Жидкая модифицированная среда Мурасиге и Скуга.

Через 4-6 недель после эксплантации зародышей на средах 1,2,3,4,5, пройдя фазу дедифференииации, образовался первичный каллус от рудиментов, полученных в комбинациях следующих скрещиваний: Vitis Longii х Parthenocisus; Vitis cinerea x Могаби (сорт сложного межвидового происхождения); Vitis solonis х Vitis vinifera (сорт Королева виноградников) и Vitis vinifera (сорт Алиготе) х Vitis rupestris (сорт Rupestris du Lot).
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллус оказался очень гетероморфным [11]. На средах 4 и 5 в основном образовывались прозенхиматозные клетки, а на средах 1,2,3 - как прозенхиматозные, так и паренхиматозные клетки. Плотный морфо- генный каллус для получения регенерантов пересаживали на модифицированную среду Мурасиге и Скуга, культивировали при освещении в 1000 люкс с 16 часовым периодом и t = 24-27 °С. Спустя 3-4 недели получили эмбриоиды, которые пассировали на модифицированную среду Мурасиге и Скуга. Каллус, отделенный от эмбриоидов, также высадили на последнюю среду, содержащую ИУК в концентрации 0,05 %, где вновь образовывались зоны плотного каллуса.
Таким образом, каллус можно индуцировать длительное время, что позволит выявить не только некоторые особенности длительного пассирования клеточных структур, но и использовать для быстрого размножения образцов. Полученные результаты согласуются с опубликованными результатами других исследователей [12].
На питательные среды 1,4,5,7 были высажены части семян с эндоспермом и зародышем, изолированные в разные сроки, от межродовых скрещиваний Vitis Longii х Partenocisus, Ampelopsis cordata x Partenocisus. Сравнительный анализ показал, что через 4-6 недель на указанных средах были получены проростки только из семян, изолированных на 40-45 дней. При этом максимальное количество растений было получено на модифицированной нами среде Уайта. Проростки для дальнейшего развития и стимулирования роста побегов и корней пересаживали и культивировали на твердой модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга.
Таким образом, в результате проведенных исследований и выполненной работы по культивированию на различных питательных средах наилучшие результаты получены на модифицированной питательной среде Уайта, а оптимальной стадией изоляции зародышей является стадия их развития на 40-45 день.
В межвидовых скрещиваниях V.solonis х V. palmata, V.solonis х межвидовой гибрид (Кентавр магарачский), V. solonis х V.candicans, было получено наибольшее количество семян. Оптимальная стадия их изолирования для получения проростков - 55 и 75-й день. Причем при изолировании зародышей на 55-й день проростки появились на 35-56-й день, а при изолировании зародышей на 75-й день - проростки появились на 19-й день.
Наименьшее количество семян было получено в межвидовой комбинации V.amurensis х межвидовой гибрид (Кентавр магарачский) и V.amurensis х межвидовой гибрид (Рислинг Магарача), у которых образовалось большое количество стеноспермокарпических, партенокарпических ягод. Высаженные на 50 и 75-й день семена этих гибридных комбинаций проросли на 33-54-й день. При скрещивании V.amurensis х V.vinifera (Мускат гамбургский) оплодотворение было безрезультатным. В межродовом скрещивании Ampelopsis cordata х Partenocisus inserfe Friisch оптимальным сроком изолирования оказался 40-й день, проростки были получены на 8,14,22-й день. Все полученные проростки были высажены на модифицированную жидкую питательную среду Мурасиге и Скуг.
Культивирование зародышей различных комбинаций скрещиваний продолжается. В настоящее время получены проростки, поддерживаемые в культуре in vitro, от скрещивания форм винограда, относящихся к родам Vitis (вид Vitis vinifera) и Parthenocissus.

Литература

  1. Клименко В.П., Волынкин В.А., Трошин Л.П. Наследование морфологических признаков виноградного листа // Цитология и генетика. - 1997. - Т. 31. С. 13-16.
  2. Клименко В.П., Волынкин В.А., Трошин Л.П. Наследование жизнеспособности семян винограда // Виноград и вино России. - 1997. - № 5. - С. 32-33.
  3. Волынкин В.А. Устойчивость винограда к серой гнили и наследование признака в первом поколении //Труды ИВиВ «Магарач». Т. XXXI. - С. 18-20.
  4. Волынкин В.А. Эффективность гибридизации у винограда // Виноград и вино России. - 2000. - № 1. - С. 11-13.
  5. Волынкин В.А. Селекция винограда на устойчивость к патогенам с точки зрения их совместной эволюции // Магарач. Виноградарство и виноделие. - 2000. -№ 1. - С. 7-9.
  6. Волынкин В.А. Экологические условия среды, как фактор формирования устойчивости винограда к патогенам Н Магарач. Виноградарство и виноделие. - 2000.-№3,-С. 17-19.
  7. Негруль A.M. Генетические основы селекции винограда. - Л.: ВАСХНЙЛ. - 1936.- 148 с.
  8. Волынкин В.А. Межвидовые сорта винограда в иерархии семейства Vitaceae и особенности межвидовой гибридизации // Труды Научного центра виноградарства и виноделия «Магарач», 2001. - Т. 3. - С. 26-30.
  9. Стоев К.Д. Физиологические основы виноградарства. - София, 1973. - 538 с. 10. К вопросу о преодолении и использовании межвидовой несовместимости сельскохозяйственных растений с помощью методов in vitro / И.М. Суриков, Т.А. Гавриленко, С.Е. Дунаева и др. // Сельскохозяйственная биология. - 1986.-№4. -С. 3-9.
  10. Matienco В., Brezeanu A., Marinescu M., Colgalniceanu G. Growth cell centers "implication in proliferation of grape berry callus" // Bulg.J.Plant Physiol. - 1998. - spesc. issue. - P. 17.
  11. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro II Физиология растений. - 1999. - Т. 46. №6.-С. 919-929.

По материалам конференции: Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства, Новочеркасск, 29-30 июня 2005 г. / ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко.

Метки: селекция |
 
< Создание и поддерживание генобанка лозы в Болгарии   Сопоставительное исследование сорта Каберне Совиньон 9-v-6 в почвенно-климатических условиях Плевенского региона >
Искать по сайту:
или внутренним поиском:

Translator

Наверх