Применение метода полимеразной цепной реакции для идентификации молочнокислых бактерий

Т.Н. Танашук, к.т.н., нач. отдела микробиологии,
B.    А. Загоруйко, д.т.н., проф., член.-корр. НААН, зам. директора по научной работе (виноделие),
C.    А.Кишковская, д.т.н., гл.н.с. отдела микробиологии,
О. Е.Кухаренко, аспирант,
Г.М. Ананченкова, инженер отдела микробиологии
Национальный институт винограда и вина «Магарач»,
Е.В. Костенко, зам. генерального директора по качеству, главный винодел
ООО «Агрофирма «Золотая Балка»

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ВИНОДЕЛИЯ

Широкое распространение и практическое использование молочнокислых бактерий (МКБ) в виноделии требует наличие быстрых методов их идентификации. В статье представлены результаты исследования применения метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для видовой идентификации МКБ. Результаты амплификации полноразмерного гена 1SS рРНК с помощью фланкирующих праймеров рА’ и рН’ среди всех полученных продуктов реакции показали наличие мажорных фрагментов длиной 1500 н.п., что соответствует типичному размеру гена 1SS рРНК. Сравнение данных видовой идентификации с использованием неспецифичного праймера (НП-ПЦР) pUCIM13 с результатами классических физиолого-биохимических тестов показало, что сходство по мажорным фрагментам совпадает с проведенной ранее видовой идентификацией штаммов МКБ на основании спектра сбраживаемых углеводов и может служить методом видовой идентификации МКБ виноделия.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, полимеразная цепная реакция, идентификация, амплификация, ПЦР-праймеры.

Анализ работ по систематике МКБ показывает, что быстро меняющиеся требования в этой области исследований, введение новых критериев и издание новых определителей делают неполными и зачастую устаревшими полученные ранее сведения о биоразнообразии МКБ, обитающих на винограде.
В настоящее время методология, используемая для обнаружения отдельных видов МКБ, включает ряд различных подходов. Существует классическая методология, основанная на культивировании организмов на соответствующих культуральных средах с последующей идентификацией штаммов. Однако идентификация МКБ классическими методами является трудоемким, длительным и дорогостоящим процессом и результаты многочисленных тестов не всегда удается интерпретировать однозначно [1, 2].

Таблица 1
Штаммы МКББ, выделенные из природных субстратов

Перспективной альтернативой трудоемким традиционным микробиологическим методам идентификации штаммов МКБ могут быть ПЦР-опосредованные методы анализа геномов, основанные на специфичной амплификации участков хромосомной ДНК с применением видо- или родоспецифичных праймеров, а также ПЦР-методы, позволяющие производить идентификацию видов и подвидов микроорганизмов с неспецифичными праймерами (НП- ПЦР).

Использование специфичных праймеров для ПЦР- реакции с бактериальной ДНК, экстрагированной из образца - это самый быстрый, независящий от культуральной среды метод родо-, видо- или штаммоспецифического обнаружения МКБ в пищевой матрице. Мишенями для таких праймеров обычно являются спейсерные участки 16S, 23S или 16S/ 23S рДНК. Амплификация генов 16S pPHK с последующим клонированием, секвенированием и филогенетическим анализом каждого гена позволяет обнаружить и оценить определенные микроорганизмы порчи, присутствующие в пищевом продукте во время технологического процесса, без применения продолжительных процедур культивирования. Такая техника способна выявлять микроорганизмы, которые пока не удалось получить в чистой культуре (некультивируемые), причем с высокой степенью чувствительности, позволяющей детектировать малые количества или даже единичные клетки микроорганизмов [1].
Методы ПЦР могут быть использованы для изучения разнообразия МКБ, обитающих на винограде, сусле и виноматериалах, что позволит описать различные новые филогенетические группы молочнокислых бактерий и может явиться чрезвычайно перспективным направлением молекулярной экологии прокариот.

Цель наших исследований - изучить возможности применения ПЦР для видовой идентификации молочнокислых бактерий виноделия путем анализа продуктов НП-ПЦР - мажорных и минорных, а также применения фланкирующих праймеров рА’ и рН’ для амплификации полноразмерного гена 16S рРНК [3].
Объекты и методы исследований. Объектами исследований являлись МКБ, выделенные нами из виноматериалов, приготовленных в различных климатических винодельческих зонах в период 2000- 2009 гг., видовая принадлежность которых определена по результатам классических физиолого-биохимических тестов и представлена в табл. 1.
Накопление бактериальной биомассы для ПЦР- анализа осуществляли путем культивирования штаммов на среде МРС (рН 4,0-4,5) при температуре (28±2)°С. Концентрацию клеток оценивали нефелометрическим методом. Для проведения ПЦР отбирали культуру при показателе оптической плотности 0,7-0,9 при длине волны 600 нм, что соответствует концентрации примерно 108-109 кл/см³ среды [4].
При подготовке к ПЦР 1 см³ культуры осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 2 мин, в пробирках “eppendorf” вместимостью 1,5 см³. Максимально удаляли супернатант и осадок промывали несколько раз 1 см³ ТЕ буфера (10 мМ Трис -HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Ресуспендировали отмытые клетки бактерий в 500 мкл TNE (STE) буфера (10 мМ Трис - HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА, рН 8,0; 0,1 M NaCl) и использовали для получения ДНК, приготовления клеточного лизата и в ПЦР [5].
Генетическая идентификация МКБ проводилась с уточнением режимов культивирования, отбора проб и оптимальных условий выделения ДНК. В работе использовали неспецифичный праймер (НП- ПЦР) - pUC/M13 и универсальные праймеры - рА-5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3' и pH - 5'AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3'.
Продукты амплификации МКБ подвергали электрофорезу в 1,8%-ном агарозном геле в присутствие красителя бромистого этидия [5].

Результаты и обсуждение. На этапе выделения ДНК молочнокислых бактерий объектами исследования служили три штамма из рабочей коллекции: П-17; К-26 и образец препарата лиофильновысушенной культуры МКБ вида Leuconostoc oenos (фирма Делер).
Для выделения ДНК использовали набор «Genomic DNA Purification Kit» фирмы «Fermentas». Методическая часть по выделению ДНК бактерий была поставлена в соответствии с протоколом, который прилагался к набору реактивов. Выделить ДНК на данном этапе не удалось, о чем свидетельствует отсутствие фрагмента ДНК на электрофореграмме (рис.1). Поэтому была проведена предобработка клеточной биомассы лизирующими веществами: 10%-ным раствором лизоцима [4] и протеиназой К с 3%-ным раствором SDS [6]. Пропись протоколов проведения этапов выделения ДНК представлена в таблице 2.
Анализ полученных данных, представленных на электрофореграмме, показывает, что применение универсального набора фирмы «Fermentas» без предварительной обработки клеток МКБ штаммов П-17; К-26 и L.oenos лизирующими ферментами не позволил получить положительного результата (вариант 7, 8, 9). В то же время предварительная обработка клеток МКБ раствором лизоцима дала положительный результат при длительности обработки в течение 2 часов (вариант 1, 2, 3).
Результаты обработки клеток бактерий 3% раствором SDS и протеиназой К (варианты 10-15) показали, что для бактерий рода Lactobacillus более предпочтительна обработка при температуре 50°С, а для бактерий рода Leuconostoc - при 60°С.  

Таблица 2
Протоколы выделения ДНК

Однако, учитывая разное количество ДНК в вариантах 14 и 15 (бактерии рода Leuconostoc), данный способ обработки клеточной массы бактерий с целью выделения ДНК требует дополнительных исследований.
Таким образом, для выделения препарата ДНК с применением универсального набора фирмы «Fermentas» нами была включена стадия предварительной обработки клеточной массы бактерий раствором лизоцима концентрацией 10 мг/см³ в течение 2-3 часов при 37°С.
Для получения большого количества однонитевой ДНК гена 16S рРНК проводили двухстадийную асимметричную полимеразную цепную реакцию с универсальными праймерами рА - 5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3' и pH - 5' AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3'. ПЦР-программа для для получения гена 16S рРНК состояла из четырех стадий: денатурация - 94°С, 60 с; отжиг праймеров - 54°С, 60°С; элонгация - 72°С, 90 с и окончательная элонгация - 72°С, 10 мин [7].
В работу были взяты чистые культуры из рабочей коллекции (табл.1).
Для оптимизации условий амплификации полноразмерного гена 16S рРНК МКБ с помощью фланкирующих праймеров рА’ и рН’ были проведены эксперименты по проведению ПЦР с различной концентрацией MgCl2 в реакционной смеси. В десяти пробах в стандартной реакционной смеси, содержащей по 16 pmol каждого праймера концентрация MgCl2 менялась от 0,5 до 2,5 мМ. Полученные результаты показали, что синтез гена с данными праймерами возможен при концентрации MgCl2 равной 0,5 мМ.
Как показали данные электрофореграммы (рис.2), у штаммов МКБ П-14, П-15, П-17, П-20, К-13, К-26 среди всех полученных продуктов реакции присутствуют мажорные фрагменты длиной 1500 н.п., что соответствует типичному размеру гена 16S рРНК [7]. Для штаммов МКБ П-19, П-21, П-22 праймер рН’ со стандартными условиями не отжигался на данных матрицах.


Рис. 1. Выделение ДНК клеток МКБ штаммов П-17; К-26 и L.oenos разными способами (табл.2): вариант 1 (1, 2, 3) - обработка 10% р-ром лизоцима при 37ОС 2 ч; вариант 2 (4, 5, 6) - обработка 10% р-ром лизоцима при 37 °С 30 мин; вариант 3 (7, 8, 9) - контроль (без дополнительной обработки лизирующими ферментами); вариант 4 (10, 11,12) - обработка 3% раствором SDS и протеиназой К 3 мин при 50°С; вариант 5 (13, 14, 15) - обработка 3% раствором SDS и протеиназой К 3 мин при 60°С.

Рис. 2. Выделение гена 16S рРНК, полученных в ПЦР с праймерами рА’ и рН’ у разных штаммов МКБ: П-14, 2-П-15, 3- П-17, 4-П-19, 5-П20, 6-П-21, 7-П-22, 8-К-13, 9-К-26.

Для видовой идентификации полученных чистых линий МКБ был применен 17-мерный олигонуклеотид pUC/M13 (5' GTTTTCCCAGTCACGAC 3'). Полимеразная реакция проводилась в следующем режиме: денатурация - 95°С, 3 мин; 5 циклов - денатурация при 95°С, 1,5 мин; отжиг праймеров при 40°С, 3 мин; элонгация - 72°С, 3 мин; 30 циклов -  денатурация при 95°С, 1,5 мин; отжиг праймеров при 50°С, 1,5 мин; элонгация при 72°С, 1,5 мин; окончательная элонгация при 72°С, 10 мин [8].
Амплификация осуществлялась с использованием стандартного состава ПЦР-смеси с уточненной концентрацией вносимого MgCl2 (из расчета на 20 мкл реакционной смеси): 10 х ПЦР-буфер с добавлением MgCl2 до конечной концентрации 0,5 мМ (2 мкл; 2 мМ dNTP mix - 2 мкл; праймер (5пМоль/ мкл) - 0,2 мкл; Taq ДНК полимераза (5 ед/мкл) -  0,3 мкл; матричная ДНК - 2 мкл; вода деионизированная - 13,5 мкл.
Для видовой идентификации исследуемых штаммов МКБ был проведен сравнительный анализ продуктов НП-ПЦР - мажорных и минорных. Результаты НП-ПЦР показали единообразие наборов мажорных фрагментов 1 и 2 образца (К-13, К-26); 4, 7, 8, и 9 образцов (П-13, П-14, П-15, П -19); 5 и 6 образца (П-17, П-20). Третий образец имел индивидуальный набор мажорных фрагментов (рис. 3).
Результаты сравнения данных видовой идентификации с помощью НП-ПЦР с результатами классических физиолого-биохимических тестов представлены в таблице 3.
В приведенных выше условиях реакции нами были получены следующие наборы характеристических продуктов: для штаммов Leuconostoc gracile, Leuconostoc oenos - 1000, 1500, 2500 н.п.; для штаммов Lactobacillus вrеvе - 2000, 3000 п.н.; для штаммов Lactobacillus plantarum - 2000, 2500, 3000 п.н.; для штаммов Lactobacillus buchneri - 1000, 2500 п.н.
Таким образом, в данном исследовании нами подтверждена возможность применения праймеров рА’ и рН’ для амплификации гена 16S рРНК, секвенирование которого в дальнейшем позволит определить структуру последовательности 16S рибосомной РНК (рДНК) молочнокислых бактерий виноделия. Данный эксперимент также показал, что требуются дополнительные исследования для амплификации с внутренними праймерами рС (341-361), рD (536-518), р1 (690-675), рF (928-908), рF (10731053), рJ (1100-1084), рG (1407-1392).
Сравнение данных видовой идентификации с помощью НП-ПЦР с результатами классических физиолого-биохимических тестов показало, что сходство по мажорным фрагментам коллекционных штаммов по результатам НП-ПЦР совпадает с проведенной ранее видовой идентификацией на основании спектра сбраживаемых углеводов и может служить методом видовой идентификации МКБ виноделия.

Рис. 3. Результаты электрофореза амплифицированных в ходе НП-ПЦР фрагментов
ДНК МКБ: 1-К-13, 2-К-26 - Leuconostoc gracile, Leuconostoc oenos; 3- П-21 - Lactobacillus buchneri; 4-П-13; 7- П-14; 8- П-15; 9- П-19 - Lactobacillus вгеуе; 5- П-17; 6- П-20 - Lactobacillus plantarum; 10 - П-22- отсутствует.

Таблица 3
Длины фрагментов ДНК штаммов МКБ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко Молочнокислые бактерии и пути их использования / — М.: Наука, 1975. -  388 с.
2. Клив де Блэкберн Микробиологическая порча пищевых продуктов. — С.-Петербург: Профессия, 2008. - 781 с.
3. Филогенетическое положение Sulfobacillus thermo- sulfidoxidans — определение, основанное на анализе первичных структур 5S и 16S рРНК/ Турова Т.П., Полторауc A.B., Лебедева И.А., Белуги на E.C., Цаплина И.А., Богдановна Т.И., Каравайко Г.И. // Микробиология. - 1995. - Т.64. -Т.3. - С.306-313.
4. Манниатис Т, Фриз Э., Сембрук Дж. Молекулярное клонирование / М: Мир. - 1984. - 394 с.
5. Moller Е., Bahnweng G., Sandermann Н. and Geiger Н. Simple and efficient protocol for isolation high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues // Food Mycol. - 1998. - 1. - P.6115-6116.
6. Определение таксономического положения бактерий из озера Байкал методом анализа последовательностей фрагментов 16S рРНК / Беликов С.И., Грачев М.А., Земская Т.И., Манакова Е.Н., Парфенова B.B. // Микробиология, 1996. - Т.65. -№6. - С.855-864.
7. Лащевский B.B., Коваленко Н.К. Конструирование праймеров к ДНК молочнокислых бактерий // Мікробілогічний журнал. - 2003. - Т.65. - №3. - С.46-52.
8. Схема быстрого выделения и идентификации Lactobacillus plantarum с использованием НП-ПЦР Валидов Ш.З, Панькова Н.В., Козлова E.B., Кузьмин Н.П., Клименко B.B., Боронин А.М. // Микробиология. - 1998. - Т.67. - №3. - С.384-390.