Вирусным инфекциям подвержены практически все виды растений, в том числе и важные сельскохозяйственные культуры. В некоторых случаях потери урожая вследствие вирусных инфекций могут достигать 50-80 %. Постоянный экономический ущерб они наносят и виноградарству.
Как следует из обзора П. Абрашевой (1983), вирусы, размножаясь в растительных клетках и используя их для своей репродукции, вызывают нарушения в обмене веществ хозяина.
Содержание хлорофилла в листьях больного винограда понижается, что, вероятно, объясняется подавлением процессов синтеза этого пигмента. Уменьшение количества хлорофилла влияет на фотосинтетическую активность листьев. Влияние на интенсивность фотосинтеза оказывает и нарушение водного режима больных растений, в результате которого наступают изменения в составе протоплазменных биоколлоидов, что, по мнению Б. Рубина (1968), является важным фактором процесса ассимиляции.
Исследованиями Б.Милкуса и С. Стыцко (1972), Б. Милкуса и Н.Еремеевой (1975) установлено, что в результате заражения растений винограда вирусами происходят изменения в белковом обмене и минеральном питании. Снижается интенсивность синтеза белка в листьях больных растений в 1,6 раза по сравнению со здоровыми растениями. Cook Y., Goheen А. (1961), на основании полученных данных, пришли к выводу, что вирус скручивания листьев нарушает нормальное распределение калия между пластинкой и черешком, изменяя уровень магния и кальция, как и взаимоотношения между этими тремя элементами.
Нарушения процесса обмена веществ ведут к задержке роста побегов. Кусты винограда, зараженные вирусом короткоузлия, вирусом бороздчатости древесины, вирусом скручивания листьев, весной развиваются значительнее позже.
Подавление роста и постепенное редуцирование надземной части зараженных вирусами виноградных растений до полной их гибели - наиболее общий симптом, на который указывают исследователи, работавшие и работающие в этой области.
На фотосинтетическую активность листьев также оказывает влияние состояние корневой системы, которая у зараженных вирусами растений развита намного слабее, чем у здоровых. Она редуцирована как в горизонтальном, так и в вертикальном направлениях. Общая длина корней у здоровых кустов больше, чем у больных, примерно в три с половиной раза. При этом у зараженных растений значительная часть питающих корней (22,56 %) расположена совсем близко к поверхности почвы (0-40 см), что является одной из причин большой чувствительности больных растений к колебаниям температуры и засухе.
Нарушая ход физиологических процессов, вирусы, в конечном счете, оказывают влияние на количество и качество продукции. П. Абрашева (1983) приводит данные многочисленных исследований (Vuittenez,1965; Boubals,1971; Legin,1972; Gartel,1971; Goheen и Cook, 1959; Lehoczky, Tasnady,1971; Alle с сотр., 1963; Vanek,1972; Orea, 1961 и др.) о снижении урожая у сортов Шардоне, Мускат белый, Пино черный, Болгар при заражении их вирусом короткоузлия на 50-90 %.
Кроме общего снижения урожая винограда при вирусных болезнях наблюдается и сильное ухудшение его качества. У столовых сортов снижение качества приводит к невозможности использовать их по назначению - на потребление в свежем состоянии, а винные сорта дают нетипичные для сорта вина. Качество вина, полученного из винограда, зараженного вирусами, ухудшается. По мнению Vanek (1971), получаются отклонения в букете и гармоничности. П. Абрашева и И. Чалков (1974) установили, что вино, полученное из винограда сорта Каберне Совиньон, зараженного скручиванием листьев, беднее алкоголем и бессахарным экстрактом. Ниже и содержание азотных, дубильных и красящих веществ. При дегустационной оценке оно охарактеризовано как нетипичное для сорта, недостаточно окрашенное, с острой кислотностью, слабым ароматом и негармоничным вкусом.
таким образом, больные растения в большинстве случаев снижают количество и качество урожая, сильно страдают от неблагоприятных условий внешней среды. Ослабленные кусты нередко преждевременно усыхают, вызывая раннюю изреженность виноградников.
Заготовка черенков на плодоносящих виноградниках без проведения массовой и фитосанитарной селекции, без тестирования на отсутствие вирусных и микоплазменных заболеваний приводит к размножению низкопродуктивных, зараженных растений. Наиболее опасна для размножения возможность латентного периода развития этих заболеваний, когда растения несут возбудителей болезней без внешних симптомов проявления болезни.
Основной способ защиты от вирусов - использование привентивных мер. Это получение здорового посадочного материала и предохранение его от вторичного заражения. В связи с основным направлением борьбы с этими заболеваниями является перевод питомниководства на безвирусную основу и ведение системы сертификации посадочного материала по образцу большинства европейских стран.
По фитосанитарному состоянию посадочный материал винограда подразделяется на 2 категории:
-свободный от вирусов (Virus free) ~ материал, свободный от всех известных вирусов и вирусоподобных заболеваний;
- тестированный на вирусы (Virus tested) - материал, свободный от особо опасных вирусов и вирусоподобных патогенов. Для указания же биологической категории в систему сертификации введены специальные термины: «предбазовый», «базовый» и «сертифицированный» материал.
Предбазовый материал {Nuclear stock) - это коллекция безвирусных клонов, растения которой используются для создания «базового» материала второй ступени размножения сертифицированного посадочного материала.
Базовый материал {Propagation stock) - это материал, который сохраняется в строго контролируемых условиях и служит для создания сертифицированного материала.
Сертифицированный материал {Certified stock) - это материал, который может быть использован как для закладки сертифицированных маточников, так и для закладки плодоносящих насаждений. Посадочный материал, полученный в результате размножения сертифицированного материала, сохраняет свой фитосанитарный статус.
Схема производства оздоровленного безвирусного посадочного материала винограда
Получение безвирусного посадочного материала методами оздоровления и тестирования (базисный, класс А, ССЭ) - лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко
|
Создание банка оздоровленного генофонда в культуре in vitro, лаборатория биотехнологии ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко
|
Первичное размножение оздоровленных клонов (базисный, класс А, ССЭ) - лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко
|
Центр предварительного размножения базисного посадочного материала класса А (Нижне-Кундрюченское отделение опытного поля ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко)
|
Маточники размножения в базовых питомниководческих хозяйствах для получения сертифицированного посадочного материала (класс Б, СЭ)
|
Плодоносящие насаждения - сертифицированный посадочный материал класса Б, категории элитный и сортовой (рядовой)
В настоящее время вопросами оздоровления посадочного материала винограда занимаются лаборатория биотехнологии ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, лаборатория биотехнологии Крымской селекционно-опытной станции им. Н.И. Вавилова и вновь созданная отлично оборудованная лаборатория в ОАО «Раевское». Однако самостоятельные, разрозненные в своих действиях лаборатории не решают проблемы в целом - от эффекта оздоровления до цен и экономической эффективности. Для решения этой проблемы необходимо создание Центра с банком оздоровленных исходных растений.
Оздоровление растений в лаборатории биотехнологии ВНИИВиВ осуществляется при помощи культуры апикальных меристем при относительном размере эксплантов 0,1-0,2 мм, так как установлено, что экспланты малых размеров являются лучшими для элиминации вирусов. Для повышения низкой регенерационной способности таких эксплантов разработана оригинальная технология микроклонального размножения, защищенная патентами. Она состоит из следующих последовательных этапов: изолирование эксплантов (центральные почки глазков) и получение асептической культуры in vitro, выделение верхушечной меристемы, индукция адвентивного побегообразования, укоренение побегов, получение пробирочных растений, высадка растений-регенератов в почвенный субстрат.
Ключевым моментом рассматриваемой технологии является регенерация целого нормального жизнеспособного растения. Успех культивирования in vitro и получение нормальных растений непосредственно связаны с оптимизаций условий на каждом этапе технологии. Как правило, даже небольшие отклонения от оптимума приводят к резкому снижению скорости роста и размножения, а также к ухудшению физиологического состояния регенератов.
С этой целью уточнено содержание цитокинина 6-БАП на этапе ввода, разработан способ повышения регенерационной способности меристем воздействием на них электромагнитным облучением низкой интенсивности (СВЧ-лучи) в комплексе с узкополосным лазером, доказана перспективность применения растительной добавки из тонкоразмолотых семян винограда и нового фиторегулятора эмистим.
Доказано, что комплексное воздействие СВЧ-лучей и лазера способствует ускоренному прохождению фаз развития меристем, увеличению размерных характеристик, снижает гибель их из-за некроза тканей и в результате этого обеспечивает повышение регенерационной способности меристем в 5,5 раза.
Схема оздоровления сортов винограда от вирусов при помощи биотехнологических методов
Проведение фитосанитарной селекции, отбор визуально здоровых кустов|
Тестирование на наличие вирусных заболеваний на травянистых индикаторах|
Заготовка черенков с визуально здоровых, протестированных кустов|
Оздоровление при введении сорта в культуру методом апикальных меристем при относительном размере апекса 0,1-0,2 мм|
- Регенерация растений из меристем (собственно микроразмножение, ризогенез, микрочеренкование)
- Тестирование полученных растений на наличие вирусов
а) методом травянистых индикаторов
б) Элиза-тест или метод ПЦР
в) методом зеленой прививки на сортах-индикаторах
|
|
Адаптация растений к нестерильным условиям|
Закладка маточника базисного посадочного материала в стационарной, пленочной теплице или в открытом грунте|
Содержание базисных клонов в условиях, исключающих их перезаражение пыльцой воздушными или почвообразующими векторами вирусов с регулярным соответствующим ретестированием|
Вегетативное размножение базисных клонов и культивирование маточников в условиях защиты от вторичного заражения с соответствующим ретестированием|
Заготовка черенков на базисном маточнике и закладка маточника сертифицированного посадочного материала и плодоносящих насажденийОптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования пробирочных растений также способствует применение СВЧ-лучей и растительной добавки из тонкоразмолотых семян винограда; введение в питательную среду 6-БАП. Под воздействием СВЧ-лучей увеличиваются суточная скорость роста в 1,7-2,4 раза, масса растений в 2 раза, длина побега в 1,7 раза, число образовавшихся узлов в 1,2-1,5 раза. При добавлении в питательную среду естественных стимуляторов роста из семян винограда эффективность клонального микроразмножения увеличивается на 27,4 %.
В процессе проведения исследований разработаны и усовершенствованы способы, направленные на улучшение регенерации растений, такие как: стерилизация исходных эксплантов, борьба с хронической инфекцией, оптимизация питательных сред, повышение регенерационной способности меристем из зимующих почек, оптимизация этапа собственно микроразмножения у труднопрофилирующих сортов винограда, адаптация растений к нестерильным условиям.
Разработан метод водной терапии вызревших микрочеренков с последующей культурой апикальных меристем для комплексного оздоровления растений от вирусов, вирусоподобных заболеваний и микоплазм. Уточнены режимы обработки, обеспечивающие приживаемость, продуктивную регенерацию и оздоровление для целого ряда сортов винограда: Степняк, Саперави северный, Цветочный, Фиолетовый ранний, Душистый, Московский устойчивый.
Установлено, что эмистим положительно влияет на рост меристематических тканей, процессы роста пробирочных растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов, повышает устойчивость к патогенам. Производственная проверка, проведенная на сорте Каберне северный, показала, что благодаря эмистиму улучшается адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям до 95-100 %.
Таким образом, разработаны способы повышения регенерационной способности меристем и, следовательно, эффективности оздоровления растений винограда от вирусной инфекции, которая подтверждена тестированием на травянистых индикаторах и при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).
