Процессы окисления вин
С. Т. ТУЙЧИЕВА, З. Ш. САПАЕВА Ташкентский химико-технологический институт
Природа процессов, протекающих в винах при кислородно-тепловой обработке, одинакова: тип вина определяется глубиной прохождения этих процессов. Качества, типичные для крепленого вина, формируются в две фазы: реакция окисления с участием кислорода и без него. В первой фазе при введении кислорода в вине образуются активные окислители — кислородные радикалы и перекисные вещества. Во второй фазе при дальнейшей тепловой обработке первичные продукты окисления интенсивно расходуются и накапливаются редуцирующие вещества.
Ряд исследователей (L. Kadamk, W. Drewts, 1986) считают, что в процессе биодеградации атакующим веществом является не фермент, а активный кислород (супероксидный анион), образующийся в результате распада перекиси водорода, выделяемой микроорганизмами. Активные формы кислорода и содержащие его радикалы могут образовываться в результате ферментативных и неферментативных реакций, определяя процесс старения вина. Кислородные радикалы — постоянные компоненты цепных свободнорадикальных процессов в организме. Они обеспечивают окисление аминокислот, спиртов и других соединений. Свободные радикалы кислорода образуются путем дисмутации по синглету. Существует следующая схема диссоциации гидроперекиси при щелочном рН (10,5-11,5)
(1)
Далее НОО реагирует с Н20, давая гидроксильные радикалы и супероксид (О2-).
(2)
В отсутствие других реакционноспособных веществ гидроксил- и супероксид-ра- дикалы взаимодействуют друг с другом:
(3)
Возможно также протекание и реакции
(4)
Количественное уменьшение кислорода в бродящей среде свидетельствует об активном взаимодействии компонентов вина с ОН- или супероксидом О2-, поэтому часть кислорода входит в состав продуктов окисления. Радикалы гидроксила и супероксида образуются по уравнению (2), являясь pH-зависимой с оптимум 11,5-11,6 (A. Gould, 1984). Он даже дает второй путь реакции диссоциации:
где М — ион металла (например, Fe++). Если учесть, что сусло и виноматериал всегда содержат ионы Fe++, то вероятнее всего в нашем случае имеет место последняя формула диссоциации перекисей.
Исследования Я. Шавела, Д. Здвигаловой (2000), М. Г. Бежуашвили, М. Ю. Месхи, М. В. Бостоганашвили, М. А. Малания (1991) и др. показали участие свободных радикалов в термообработке вин. Для подтверждения, что вышесказанное имеет место при портвейнизации сухого виноматериала, докрепленного до 14,5 об.% и пропущенного через насадку дрожжей, скупажированного до кондиций портвейна, мы оценивали торможение образования свободных радикалов при участии супероксиддисмутазы, содержание которой высоко в дрожжах. Данный фермент переводит свободные радикалы О2 в перекись водорода, который затем при участии каталазы расщепляется на Н2О и атомарный О2. Реакция Майера может объединять образование радикалов, одновременно потребляя растворимый кислород, чем объясняется ее окислительный и аминокислотный характер (S. Zeise, J. Klein, L. KrohL., L. Stroesser, 1991). Она обеспечивает комплекс реакций окисления компонентов вина, начиная с реакций кислорода с водой в кислой среде.
Мы поставили эксперимент с целью установления наличия и роли супероксида при непрерывной генерации кислорода в присутствии микроорганизмов Saccharomycesoviformis 96-К, обладающего окислительной функцией. Для этого через насадки с иммобилизованными на нее дрожжами Saccharomycesoviformisпри постоянной аэрации пропускали виноматериал с постоянной скоростью. Активность супероксиддисмутазы определяли по методу, основанному на способности фермента тормозить реакцию восстановления нитротетразолиевого синего. Инкубационная среда для определения активности фермента содержала Na- пирофосфат-ЭДТА буфера, рН 8.3, нитро-тетразолевый синий «Chemopol» 200 мкг/л, феназинметосульфат «Ferak» 69 мкг/л, 0,0002 М НАДН «Reanal» и супернатант из виноматериала. (Для этого в исследуемый материал добавляли трисбуфер, этанол и хлороформную смесь. Все содержимое энергично встряхивали, закрывали крышку, оставляли на ночь в холодильнике. На следующий день центрифугировали при 3000 об/мин). Затем виноматериал спектрофотометрировали при длине волны 535 нм против контроля. Расчет вели по проценту торможения Т (см. таблицу) восстановления нитротетразолиевого синего.
Активность супероксиддисмутазы рассчитывали по формуле:
где А — активность фермента (усл. ед/мин. мл); Т — процент торможения; 0,2 — количество взятого супернатанта.
Акцептором электронов при окислительных реакциях в микроорганизмах (Ю. Л Жеребин, В. Л. Куев, З. Н. Кишковский, 1988) выступает кислород, а промежуточным продуктом, видимо, заряженный супероксидный радикал. В растворах радикал взаимодействуете компонентами вина, в первую очередь с фенольными веществами PhOH.
По результатам ранних статей (С. Г. Туйчиева, С. Х. Абдуразакова, З. Ш. Сапаева, Б. А. Абдуллаева, 2003) при введении в бродящее сусло с различных дозами кислорода известно, что умеренная аэрация благоприятствует высокой активности ферментов дрожжей. По этим соображениям скорость потока отрегулировали из расчета неполного насыщения среды кислородом. На наш взгляд, участие дрожжей приводит к усилению окисления органических соединений и поддержанию высокого уровня АТФ для деятельности дрожжей, длительному сохранению их биологической активности. Концентрация кислорода в период всего эксперимента во все сроки исследования сохраняется высокой. Вместе с тем можно предположить, что активизация окисления усиливает метаболизм находящихся в среде жирных кислот и аминокислот, в частности фенилаланина и восстановленного глутатиона.
Для подтверждения эффективности биобработки, наряду с определением уровня 02, измеряли концентрацию иона водорода (рН) и установили неизменность кислой среды рН, равного 5-6, характерную для нашего продукта. В дальнейшем изучали интенсивность образования свободных радикалов при термообработке.
Нитротетразолиевый метод определения активности супероксиддисмутазы показал блокирование зарождения свободных радикалов на 1-3-е сутки в среднем до 80%, что, видимо, было связано с высокой активностью фермента дрожжей. Через 4-6 сут процесс торможения образования свободных радикалов составил в среднем 30-35 %, и лишь к заключительному сроку мы наблюдали существенное снижение торможения свободных радикалов. Это наблюдается при температуре инкубации как 50, так 70 °C. Можно предположить, что в ранние сроки исследования активизируются ферментные системы ответственных за выработку активных форм радикалов: ферредоксин- железо-серопротеиды, ферредоксин- НАДФ-оксидоредуктазы, М-гидроксибен- зоатредуктазы, альдегидоксидазы. Параллельно возрастает активность супероксиддизмутазы.
Согласно полученным данным ферментативные реакции блокирования образования свободных радикалов преобладают на 1-4-е сутки эксперимента. На наш взгляд, это связано с высокой активностью супероксиддисмутазы дрожжей. Однако, так как она является белком, естественно можно предположить, что в процессе длительной термообработки при 50...70 °C активность ее вследствие денатурации будет снижаться, что способствует подавлению, торможению ферментативного образования свободных радикалов кислорода. С другой стороны, по мере активизации спиртового и молочнокислого брожения в дальнейшем блокирование супероксидных радикалов замедляется и в среде накапливается перекись водорода. Вместе с тем, следует сказать, что сохранение высоких значений свободных радикалов кислорода в среде на 4-12-е сутки активизирует гидроксилазы фенольных соединений, и это приводит к усилению синтеза фенолокислот и полифенолов, составляющих значительную часть фенольной базы вин.
Действительно, по результатам анализа в течение 1-2 сут активность супероксиддисмутазы сохранялась в пределах 22,32 усл. ед./(мин/мл). В дальнейшем фермент ингибируется приблизительно в 8-10 раз относительно значений за предыдущие сроки, обеспечивая тем самым торможение образования (лишь 30-34 %) активных форм кислорода. Еще большее угнетение наблюдается на 8-10-е сут., когда значения активности фермента равны 0,52-0,34 усл. ед./(мин/мл). Это совпадает с замедлением, торможением (6-9 %) свободных радикалов данной ферментной системы.
Так как реакция Майера может объединять образование радикалов, одновременно потребляя растворимый кислород, можно сказать, что она объединяет в себе как окислительные, так и антиокислительные свойства и обеспечивает комплекс реакций окисления органических соединений, начиная с реакции кислорода с водой в кислой среде.
Вместе с тем можно сказать, что в процессе деятельности супероксиддисмутазы в высоких концентрациях образуется Н2О2, который расщепляется на атомарный О2 и Н2О. Видимо, этот процесс имеет важное значение для поддержания высокого уровня концентрации кислорода.
Таким образом, предлагаемый способ обработки вина не приводит к снижению концентрации кислорода в пробах при термообработке, рН среды и усилению образованию свободных радикалов (последнее связано в ранние сроки с деятельностью супероксиддисмутазы дрожжей, а в более поздние сроки с накоплением антиоксидантов, препятствующих развитию цепных реакций).
