Существующие методы определения этих фракций или, как их называют 'форм' воды, построены на отнятии воды путем высушивания (М.М.Тюрина, 1957), замораживания - колориметрические методы, действия гипертонических растворов сахарозы по принципам, предложенным Думанским в 1948 г.. (М.М.Окунцов и О.П.Левцова, 1952; А.Ф.Маринчик, 1957; Н.А.Гусев, 1959, 1962, и т.п.).
Следовательно, получаемые экспериментальным путем величины зависят прежде всего от размера применяемых водоотнимающих сил. Понятие фракции 'свободной' воды становится весьма условным, тем более, что для отнятия воды от клеток всегда требуется приложение каких-то усилий. По-видимому, такая трактовка не может объяснить наблюдаемые в эксперименте изменения и будет справедливее говорить об изменении водоудерживающих сил, связанных с метаболизмом клетки, благодаря которому степень трудности отнята воды, измеряемая величиной отнимающих сил, может изменяться как в онтогенезе, так и в процессе адаптации растения к непрерывно варьирующей напряженности факторов внешней среды (В.В.Гриненко, 1959,1960
Назовем основные принципы метода изучения формирования и проявления свойства устойчивости у растения, основанного на степени резистентности клеток к неблагоприятным условиям.
- Поскольку изменение водоудерживающих сил клетки является интегральным свойством, отражающим адаптивный метаболизм клеток и тканей растения, можно использовать это свойство в качестве критерия устойчивости сортов и видов.
- Для практического использования этого критерия необходимо вести исследование в динамике, придерживаясь не строго календарных сроков, а приурочивая исследования к резким изменениям условий внешней среды и этапам органогенеза растений.
- Объектами исследований должны служить те органы растения, устойчивость которых непосредственно интересует исследователя. Так, например, довольно трудно методом интерполяции составить суждение о зимостойкости растения, исследуя водоудерживающую способность листьев в летний период. Нельзя получить,например, представление об устойчивости плодовых почек к низкой температуре и засухе, подвергая макроанализу почку в целом. Следует анализировать те отпрепарированные органы, которые подвергаются повреждениям (пестик, рыльце, семяпочка и др.)
- При отсутствии методов исследования с сохранением нативной структуры наиболее приемлемым из числа существующих методов можно считать применение гипертонических растворов сахарозы для отнятия воды из тканей растения с возможно меньшим повреждением клеток. Несмотря на существенные недостатки этого метода, он пока может служить критерием степени устойчивости отдельных сортов и форм винограда и других растений.
- Множественность связей молекул воды, определяющая прочность ее удержания клеткой, заставляет применять принцип дифференцированного учета степени прочности с использованием ряда водоотнимающих факторов.
Применение раствора только одной какой-нибудь концентрации ограничивает возможность суждения о степени устойчивости того или иного сорта. Использование только высокой концентрации (Маринчик,1957) сглаживает существенные различия в устойчивости сортов. Использование слабой концентрации не позволит проследить формирование устойчивости в динамике. Получение не одной точки, а кривых удержания воды клетками растения дает достаточно четкое представление о развитии водоудерживающих сил в зоне наиболее существенных изменений. При последующем установлении корреляции с отдельными решающими звеньями обмена веществ это имеет большое значение. При этом следует иметь в виду замечания Н.А. Гусева (1962) о нетождественности понятий водоудерживающей силы клетки и количества отнятой и удержанной воды при одной величине водоотнимающего реагента. Для характеристики собственно о водоудерживающих сил следует установить величины водоотнимающих факторов для отнятия одного и того же количества воды при разных условиях.
Концентрация используемых растворов сахарозы не может быть стандартной. Пределы ее колебаний устанавливаются в связи со спецификой исследуемого объекта. Наиболее низкая концентрация должна быть немного выше сосущей силы клеток в период наиболее легкой отдачи ими воды.
Для виноградной лозы наиболее приемлемы следующие концентрации растворов сахарозы - 20%, или 16 атм; 30%, или 34 атм.; 40%, или 5 6 атм; 30%, или 03 атм. Концентрацию растворов проверяют рефрактометрически.
6. Величина навески и количество гипертонического раствора также зависят от особенности изучаемого объекта. При большой навеске и малом количестве раствора происходит быстрое уменьшение концентрации раствора, реагирующего с тканями. При малой навеске изменение концентрации трудно уловить и оно недостоверно. Для виноградной лозы оптимальным соотношением является 2-3 мл раствора и 0*4-0,5 г тканей. Отрезки должны равномерно распределяться и находиться в одинаковых условиях взаимодействия с раствором. Отрезки ткани с только что срезанных растений (непосредственно на экспериментальном участке) помещают р заранее взвешенные бюксы с гипертоническим раствором сахарозы. Одновременно отбирают пробу для определения содержания влаги.
Техника определения. Взвешивают пустые бюксы (с точностью до 4 знака), затем наливают 3 мл сахарного раствора и снова взвешивают для определения веса 3 мл.
Затем помешают высечки листа или части других органов растения с таким расчетом, чтобы навеска была всегда приблизительно одинакова (для листьев~300-350 мг, для лозы - 400-500 мг). Размер навески находят эмпирически для каждого объекта с таким расчетом, чтобы разницу в концентрации раствора после выхода воды в раствор из тканей можно было уловить рефрактометрически. Бюксы с навеской снова взвешивают, помещают в эксикатор и выдерживают строго определенное время. Экспозицию тякур устанавливают эмпирически. Для наших объектов (виноград, яблоня) достаточно трех часов. Выдержав эту экспозицию, сахарные растворы из бюксов с растениями после перемешивания просматривают в рефрактометре при 20°С. По показателю преломления раствора сахарозы находят его концентрацию. Параллель- 40 ставят бюксы с сахарным раствором без высечек. Их открывают во время наполнения опытных бюксов и выдерживают в тех же условиях. Исходную концентрацию раствора определяют из содержимого этих бюксов для нивелирования посторонних влияний, не принимая во внимание изменения концентраций за счет воды, вышедшей из клеток и тканей.
Расчет. Пусть вес 3 мл 50-процентного раствора сахарозы равен 3,5290 г, показатели преломления - 1,4200, концентрация, найденная по таблице- 50%, величина навески - 0,3110' г, показатель преломления после трехчасовой реакции с растением - 1,4189, т.е. концентрация равна 49,5%.
Находим вес сахара, содержащегося в растворе:
После реакции с растением концентрация раствора за счет выделения воды снизилась до 49,5%, следовательно, 1,7645 г сахара составляет теперь в растворе 49,5%. Находим общий вес раствора (вместе с отнятой у растения водой)!
Разница между первоначальным и последующим весом представляет количество отнятой у растения воды: 3,5646 - 3,5290 = 0,0356 г.
Такое количество воды отдано навеской, равной 0,3110 г.
Удобнее выражать отнятую воду в процентах от общего ее содержания в исследуемой ткани.
Вода, оставшаяся в тканях, при данной величине водоотнимающего фактора представляет разницу между общим содержанием воды и водой отнятой. Пусть общее содержание влаги равно 68,85%, тогда вода, удержанная клетками будет составлять 88,95-11,44=>57,51%.
Выражая ее в процентах от общего содержания влаги, поручаем, что 83,40% воды удержано тканями и не отнимается данным ведоотнимающим фактором.
Исходя из вышеизложенного, нами была предпринята попытка установить сопряженность этого явления с изменением свойств протоплазмы и звеньями обмена веществ, которые по нашему мнению. должны играть существенную роль. Это прежде всего специфичность белков и установленное существование общего динамического равновесия, при котором происходят непрерывный синтез и непрерывное разрушение белков (А.Манстер, 1961), а также процессы дыхания клеток, обусловливающие возможность этих превращений, Наиболее быстро действующим фактором на скорость и характер протекающих в растении процессов является температура. Поэтому основное внимание было обращено на изменение свойства термочувствительности протоплазмы. Для этой цели используют несколько модифицированный электрометрический метод Декстора с установлением температурных порогов денатурации биоколлоидов по экзосмосу электролитов. Тонкие срезы ткани виноградной лозы в бидистилляте термостатируются в течение 30 минут в ультратермостатах в строго определенных условиях. После охлаждения вытяжку сливают в потенциометрическую ячейку и замеряют ее сопротивление при помощи реохордного моста Р-38 при температуре 20 С.
Серию опытов проводят в пределах температурной шкалы от 25 до 65 с интервалами 1 С.
Контролем служит вытяжка после 30 минут кипячения тканей. Затем строят температурные кривые с откладыванием на оси абсцисс температуры и на оси ординат — найденной величины электропроводности. По термическим порогам денатурации судят о степени резистентности протоплазмы клеток.
Параллельно ведутся методические поиски в области электрофоретического разделения белковых фракций с использованием синтетического акридамидного геля (В.И.Сафонов и М.Сафонова, 1964).
При исследовании дыхания используют обычный манометрический метод Варбурга и блокирование отдельных систем для выяснения их роли в формировании водоудерживающих сии при помощи общеизвестных ингибиторов.
Такой комплексный подход к решению вопроса о значении водоудерживающих сил клетки в устойчивости растения и сопряженности этого явления с определенными звеньями обмена веществ позволит, по всей вероятности, ближе подойти к пониманию сущности защитных механизмов, предохраняющих клетки растения от повреждения и гибели и возможности диагностирования оценки устойчивости сортов и форм винограда.
