Изучение генетических ресурсов винограда Украины в рамках международных проектов

В. И. Рисованная, к.б.н., в.н.с. отдела биологически чистой продукции и молекулярногенетических исследований,
С. М. Гориславец, к.б.н., н.с. отдела биологически чистой продукции и молекулярногенетических исследований,
Э. Ш. Меметова, к.с.-х. н , с.н.с. отдела биологически чистой продукции и молекулярногенетических исследований,
В. А. Володин, аспирант отдела биологически чистой продукции и молекулярногенетических исследований
Национальный институт винограда и вина «Магарач»

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ВИНОГРАДА УКРАИНЫ В РАМКАХ МЕЖДУНАРОДНЫХ ПРОЕКТОВ

В статье представлены результаты работы лаборатории молекулярно-генетических исследований НИВиВ «Магарач» в рамках международных проектов Греция-Украина, IPGRI, ECO-NET , COST FA 1003 и др., которые с очевидностью демонстрируют достижения международного сотрудничества в области молекулярных исследований винограда.

Ключевые слова: виноград, генетические ресурсы, молекулярные маркеры, генетическая база данных.

Молекулярно-генетические исследования на сегодняшний день занимают лидирующее положение в области идентификации и сертификации сортов различных культурных растений. Применение ДНК-технологий позволило существенно расширить возможности традиционной селекции, ампелографии и генетики винограда. Только анализ ДНК, который напрямую характеризует генотип, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики сорта, практически пригодные для идентификации генотипов, паспортизации и регистрации сортов, выявления синонимов и омонимов в коллекции, охране авторских прав селекционеров и защите продукции растениеводства от возможной фальсификации. Необходимость контролировать ввозимые и реализуемые внутри страны партии посадочного материала также требует применения методов идентификации, основанных на стабильных характеристиках, к которым относят методы анализа ДНК. Использование молекулярных маркеров не зависит от фенотипа, не является тканеспецифичным и их можно использовать на любой стадии развития растений. Методы ДНК-генотипирования при помощи анализа микросателлитных локусов или SSR-локусов (simple sequence repeate - простые повторяющиеся последовательности) имеют ряд преимуществ по сравнению с другими молекулярными маркерами. Они характеризуются высоким полиморфизмом, кодоминантным типом наследования, распространены по всему геному и позволяют получать уникальные генетические профили (молекулярно-генетические паспорта) исследуемых образцов, т.е. идентифицировать их. Идентификация методом SSR-ПЦР основывается на определении аллельного состава микросателлитных локусов исследуемых образцов (например, сортов) и является основой для последующей паспортизации и регистрации сортов [1, 2].
Технология «микросателлитного профилирования» активно используется в европейских лабораториях для исследования генетического разнообразия винограда, а с 2001 г. - и в лаборатории молекулярно-генетических исследований НИВиВ «Магарач». Исследования были начаты в 2001-2003 гг. при выполнении двустороннего проекта Греция-Украина: «Разработка мультимедийной web-baсked генетической базы данных украинской, молдавской и российской зародышевой плазмы винограда Vitisvinifera». Проект был направлен на исследования генетических ресурсов винограда Украины, России и Молдовы с использованием молекулярных маркеров. Одной из задач проекта была разработка методических аспектов микросателлитного профилирования (SSR-анализа) сортов винограда. Часть исследований была выполнена на базе Лаборатории физиологии и биотехнологии растений Критского университета, где также стажировалась сотрудник института Гориславец С.М. Для идентификации сортов использовали методику SSR-анализа, которая основана на генотипировании в определенных локусах, названных микросателлитами. Для идентификации и дифференциации использовали 9 микросателлитных локусов: VVS2, SsrVrZAG21, SsrVrZAG47, SsrVrZAG62, SsrVrZAG64, SsrVRZAG79, SsrVrZAG83, UCH 11, UCH 29. В результате выполнения данного проекта была создана коллекция образцов ДНК 109 украинских, российских и молдавских аборигенных сортов винограда. По результатам микросателлитного профилирования были получены уникальные ми- кросателлитные профили сортов, выполнена дифференциация сортов, а также созданы генетическая база данных, информационная база данных и ампелографическая база данных (база данных изображения) [3].
Начатые исследования были продолжены в рамках международных проектов, выполняемых совместно с европейским странами: Люксембург, проект IPGRI (2004-2009 гг.), Франция, ECO- NET (2006-2007 гг.), Италия, Cost action FA1003 (c 2010 г., рис.). Эти проекты посвящены сохранению, изучению и рациональному использованию генетических ресурсов винограда. В рамках этих проектов вед.н.с. к.б.н. Рисованная В.И., к.б.н. Гориславец С.М. и аспирант Володин В.А. проходили тренинги в ведущих европейских лабораториях: в лаборатории биотехнологии Центра государственных исследований (Люксембург), в лаборатории «Разнообразие и геном» (г. Монпелье) и на Опытной станции (г. Кольмар) Института агрономических исследований - INRA (Франция), в институте им. Юлиуса Кюна (Зибельдинген, Германия) (Julius Кьhb- Institut (JKI). Полученный на стажировках опыт сотрудников помог в создании и работе лаборатории молекулярно-генетических исследований в нашем институте.
С 2003 г. институт представляет Украину в Европейской рабочей группе винограда. На первом совещании этой группы в Палике (Сербия) в 2003 г. были предложены шесть полиморфных микросателлитных локусов VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 и VRZAG79 как необходимый минимальный набор для генотипирования, идентификации, дифференциации и классификации сортов винограда [1]. Впоследствии, в рамках проекта GrapeGen06 (ЕС), количество микросателлитных локусов было дополнено локусами VVMD25, VVMD28 и VVMD32 [2].
Проект IPGRI (2004-2009 гг.) координировался Европейским отделением Международного института генетических ресурсов растений (сейчас Biodiversity International, Рим, Италия), в частности его доректором Йозефом Туроком и был посвящён изучению происхождения культурного винограда, сохранению и изучению генетических ресурсов винограда стран Причерноморского бассейна. Проект финансировался правительством Герцогства Люксембург и был выполнен в рамках программы ECP-GR, которая представляет собой совместную многостороннюю программу с участием большинства европейских стран, направленную на обеспечение долгосрочного хранения генетических ресурсов растений и облегчение их более широкого использования в Европе. В проекте участвовали Италия, Люксембург, Германия, а также страны Кавказа и северные регионы Черного моря: Азербайджан, Армения, Грузия, Республика Молдова, Российская Федерация и Украина. Генофонд винограда региона между Черным и Каспийским морями вызывает к себе пристальное внимание, т.к. данный регион является одним из центров происхождения и оккультуривания евразийского винограда. Основные направления деятельности проекта - идентификация, сбор, характеристика и сохранение генофонда винограда, расширение использования национальных генетических ресурсов стран-участниц. В рамках проекта была составлена объединенная база данных сортов винограда, включающая более 2600 сортообразов, в т.ч. аборигенных сортов и дикорастущих форм. Некоторые местные сорта Грузии и Украины были идентифицированы по молекулярным маркерам совместно с Миланским университетом и Научным Центром Габриел Липпман (Люксембург) [4, 5]. С целью сохранения генофонда были основаны новые коллекции местных сортов в Азербайджане, Армении, Грузии и РФ. В 2004 г. НИВиВ «Магарач» был организатором второй рабочей встречи по данному проекту по результатам которой был подготовлен сборник статей участников совещания [6]. В рамках проекта IPGRI, в 2006 г. институт выиграл грант на финансирование создания лаборатории молекулярно-генетических исследований. Руководитель гранта - к.б.н., зав. лаб. МГИ Рисованная В.И.
Первая рабочая встреча по проектам ECO-NET и GrapeGen06 (ЕС) была организована Роберто Бачильери из Института Сельскохозяйственных Исследований Франции (INRA), которая проходила в ноябре 2006 г. в г. Монпелье (Франция). В результате был инициирован исследовательский проект ECO-NET: «Генетические ресурсы культурного и дикого винограда, описание, оценка и использование старых сортов и диких генотипов». Основная цель проекта - создание координированной модели сохранения генетических ресурсов. В рамках проекта участники договорились о взаимном обмене образцами разных форм винограда (дикие виды, сорта, селекционные сорта, клоны и т.д.) и о совместных исследованиях разных форм винограда по молекулярным маркерам. Программа ECO-NET финансировалась Министерством сельского хозяйства Франции. На встрече были рассмотрены вопросы сотрудничества в рамках этих проектов. В результате отдельно было инициировано соглашение о научном, технологическом и культурном сотрудничестве между НИВиВ «Магарач» и INRA. Программа встречи включала посещение известной европейской ампелографической коллекции винограда «Vassal» (UEDV), Селекционного центра и коллекции клонов Национального центра усовершенствования виноградарства (ENTAV). ENTAV и INRA являются центрами получения и сертификации клонов во Франции. Участников ознакомили с научными исследованиями, проводимыми в лаборатории «Разнообразие и геном культурных растений» INRA: исследование генома винограда по молекулярным маркерам, методами культуры клеток и тканей, криогенное консервирование и др.
Для лучшего понимания процесса окультуривания винограда в рамках международного сотрудничества в 2003-2005 гг. был проанализирован полиморфизм генома хлоропластов в сортах винограда и диких формах Vitis sylvestris, произрастающих вокруг Средиземного моря. Курировал совместное исследование проф. Жозе Мартинез Запатер из национального Центра Биотехнологии (Мадрид, Испания). Было изучено 10 микросателлитных локусов хлоропластов винограда. Только три локуса, которые были использованы, оказались полиморфны и были использованы, чтобы охарактеризовать гаплотипы хлоропластов более чем 500 столовых и винных сортов винограда, выращиваемых вокруг Средиземного моря, а также более 100 диких форм Vitis. В рамках этого исследования в лаборатории молекулярно-генетических исследований был изучен полиморфизм генома хлоропластов 48 крымских, 27 молдавских и 24 российских аборигенных сортов винограда, произрастающих в ампелографической коллекции НИВиВ «Магарач» [7]. Результаты совместного исследования показали существование по крайней мере двух главных очагов оккультуривания, один на Ближнем Востоке и второй в Западной Европе, которая давала начало многим из западно-европейских культурных сортов винограда [8].
С 2010 г. сотрудники лаборатории МГИ Института принимают активное участие в международном проекте COST Action FA1003 GRAPENET - «Сотрудничество между западом и востоком по изучению разнообразия виноградной лозы и мобилизации адаптивных признаков для селекции». Система грантов COST обеспечивает финансирование по Проекту COST совещания, краткосрочные научные командировки (STSMs), обучающие школы и т.д. Исследования данного проекта направлены на объединение усилий исследователей из стран Восточной и Западной Европы для изучения в широком географическом масштабе генофонда виноградной лозы в целом ряде стран географического разнообразия и мобилизации адаптивных признаков в целях селекции и стабильного использования этой ценнейшей садоводческой культуры. Особое внимание уделяется изучению генетических ресурсов винограда в предположительном регионе его окультуривания (юго-восток Европы и особенно Кавказ), а также по миграционным путям народов.
Сотрудничество селекционеров и ученых на международном уровне в рамках проекта позволяет получить знания об этом ценном разнообразии, его моделях, процессах и корреляциях с такими признаками как устойчивость и качество плодов. Обмен опытом, совместная ответственность, общий доступ к информации и материалам для разработки методов фенотипирования по шкале BBCH и исследований по ассоциативной генетике в базовых коллекциях значительно усилят эффект исследований, выполняемых каждым партнером, и выведут инновационные области исследований на европейский уровень. В результате выполнения данного проекта в лаборатории НИВиВ «Магарач» создан банк данных по результатам фенологического наблюдения и агробиологической характеристики 52 сортов винограда по шкале BBCH, а также по результаты энохимического и энокарпологического анализа сортов винограда по шкале BBCH. Таким образом настоящий Проект внесет долгосрочный вклад в улучшение знаний о винограде, его долгосрочное сохранение и повышение качества производства винограда в Европе.
В исследованиях лаборатории МГИ в качестве материала для изучения генетического разнообразия винограда были использованы не только крымские, молдавские и российские аборигены, но и селекционные сорта и их родительские формы, сорта, зарегистрированные в Национальном реестре Украины, дикие формы винограда. Часть сортов проанализирована по 9 микросателлитным локусам, рекомендованным европейской базой винограда. Некоторые сорта были изучены с использованием 23 SSR-локусов.

Рис. Научное сотрудничество в рамках международных проектов

указываются как нижние индексы возле названия микросателлитного локуса.
На основании полученных микросателлитных профилей проводится паспортизация сортов. В рамках совместных европейских проектов GenRes 081/1994-2002 и GrapeGen06 (EC), разработан стандарт для маркирования генотипов винограда с использованием кодов эталонных аллелей, которые
CH1CH2 VVMD7CF1TR1
VVMD25CS1CF2 VVMD27CF1CS2
VVMD28chich2 VVMD32 cs1mu2 VrZAG62 chich2 VrZAG79CH1CH2.
Однако универсальным вариантом кодирования размеров аллелей
VVS2CH1CH2 VVMD5
микросателлитных локусов признан вариант «n+х», который и предложен как основная запись формул генотипов винограда (молекулярно-генетических паспортов) на основе анализа микросателлитных локусов [1]. Так, например, коды генотипов наших аборигенных сортов записываются в следующем виде:
Асма
VVS2 n+12n+14 VVMD5 n+4n+14 VVMD7 n+12 n+18 VVMD27n+10 n+14 VrZAG62n+26 n+26 VRZAG79n+10 n+14
Капсельський
VVS2 n+20 n+26 VVMD5 n+6 n+14 VVMD7 n+8 n+22 VVMD27n+4 n+8 VrZAG62n+26 n+30 VRZAG79 n+12 n+14
Кокур белый
VVS2 n+22 n+22 VVMD5 n+6 n+16 VVMD7 n+8 n+18 VVMD27n+12 n+14 VrZAG62n+26 n+26 VRZAG79 n+14 n+15
Предложенная система обозначения аллелей и записи генотипов винограда (молекулярногенетические паспорта) позволяет преобразовывать полученные микросателлитные профили в форму, удобную для сравнения результатов, полученных в разных лабораториях, в разных странах и на приборах разных марок.
Как результаты ДНК-типирования нами созданы молекулярно-генетические паспорта более сотни сортов винограда, которые вместе с информацией о родословной и основными ампелографическими признаками могут быть использованы в качестве наиболее точной сертификационной системы в государственных стандартах регистрации сортов. Молекулярно-генетические паспорта как элемент регистрации сортов позволяют повысить уровень защиты интеллектуальной собственности. Они также могут быть использованы при изучении исходного материала в селекции, установлении оригинальности и генетической однородности сорта при государственном сортоиспытании, а также при оценке сортовой подлинности и чистоты посадочного материала. Это также актуально при контроле качества и оценки аутентентичности сортовых вин. Молекулярно-генетические паспорта изученных нами образцов винограда объединены в базу данных. Установлена возможность экспресс-оценки гибридных сеянцев на ранней стадии развития, оценки стабильности микросателлитных профилей генотипов винограда после их длительного культивирования в условиях invitro.
На Украине особое внимание уделяется качеству посадочного материала винограда. В связи с этим в лаборатории молекулярно-генетических исследований института проводится тестирование латентной стадии бактериальных и вирусных инфекций винограда. Исследования выполняются в соответствии с международными стандартами. В рамках производства сертифицированного материала сортов и подвоев винограда выполняется тестирование методом ПЦР и ИФА латентной стадии вирусной и бактериальной инфекции посадочного материала сортов Каберне Совиньон, Пино черный, Совиньон зеленый, Кобер 5-ББ, Мерло, Шардоне, Мускат Оттонель, Красень, Подарок Магарача, Бастардо и др. Ведётся работа по поиску маркеров, тесно связанных с хозяйственно ценными генами (MAS-селекция).
Результаты, которые были получены в этих проектах, с очевидностью демонстрируют достижения международного сотрудничества в области молекулярных исследований винограда.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. This P., Jung A., Boccacci P. et al. Development of a standard set of microsatellite reference alleles for identification of grape cultivars // Theoretical and Applied Genetics. - 2004. - V.109. - P.1048-1058.
2. This P. Microsatellite markers analysis // Minutes of the First GrapeGen06 Workshop March 22nd and 23rd, 2007 INRA, Versailles (France). - P.3-4.
3. Lefort F., Massa M., Goryslavets S., Risovanna V. and Troshin L. Genetic profiling of Moldavian, Crimean and Russian cultivars of Vitis vinifera L. with nuclear microsatellite markers. // In:Oenologie. - Paris: Editions Tec & Doc, 2003. - P. 71-73, 694 p. ISBN 2-7430-0649-8.
4. D. Maghradze, O.Failla, S. Gorislavets, E. Maul, V. Risovanaya, et al. Conservation and Sustainable Use of Grapevine Genetic Resources the Caucasus and Northern Black Sea Region //ISHS Acta Horticulturae. - 2009. - V. 827. - P.155-158.
5. Heuertz M. Characterization of grapevine accessions from Ukraine using microsatellite markers / M. Heuertz, S. Goryslavets, J. F. Hausman, V. Risovanna // Am. J. Enol. and Vitic. - 2008. - V. 59. - № 2. - P.169-178.
6. M. Bozzano, J.Turok. Development of national programmes on plant genetic resources in Southeastern Europe (IPGRI). Second Project Meeting. - Jalta, 2004. - 90 p.
7. Рисованная В., Arroyo-Garsia R., Гориславец С., Lefort F., Martinez- Zapater J. Анализ полиморфизма генома хлоропластов аборигенных сортов винограда Крыма: Сборник тезисов IV Международной конференции: «Геном растений» 10-13 июня 2003 г. - С.30.
8. Arroyo-Garcia, R., Ruiz-Garcia, L., Bolling, L., Ocete, R., Lopez, M.A., V.Risovannaya, S.Gorislavets et al. Multipl origins of cultivated grapevine (Vitis vinifera L. ssp. Sativa) based on chloroplast DNA polymorphisms// Molecular Ecology. - 2006. - V.15. - P.3707-3714.