Укоренившиеся в практике методы количественного определения пектиновых веществ основаны на учете продуктов их гидролитического расщепления. В зависимости от вида учитываемых продуктов гидролиза пектиновые вещества принято выражать условно: или по пектиновой кислоте (кальций - пектатный метод), или по галактуроновой кислоте (метод Толлекса и Лефевра). Оба метода длительны и громоздки.
Свойство пектинов количественно осаждаться ионами Двухвалентной меди было положено в основу разработки нового объемного метода определения пектиновых веществ, при котором связанная с пектинами медь определяется йодометрически.
Впервые этот метод разработали в 1954 г. М.А.Соболев и А.А.Красивская, которые определяли в льняных волокнах параллельно пектат кальция - весовым методом и связанную с пектинами медь - йодометрически.
На основе полученных данных авторы нашли, что отношение процента пектата кальция к проценту меди дает постоянную величину, коэффициент пересчета меди на пектат кальция.
В 1962-1964 гг. нами проводились массовые анализы различных сортов винограда, плодов а ягод по определению в них пектиновых веществ параллельно весовым и объемным методами. Пектиновые вещества определялись суммарно-протопектин и водорастворимая фракция.
При этом оказалось, что для различных сортов величина отношения найденного процента пектата кальция к проценту меди не совпадает, хотя значения этих величин и близки. По-видимому, сказываются сложность и неоднородность строения пектиновых веществ, их специфический состав в каждом сорте.
Принимая, однако, во внимание общепринятую условность количественного выражения пектинов, для сравнительной оценки сортовых особенностей винограда и других плодово-ягодных культур по показателю пектиновых веществ можно применить следующие, выведенные как среднеарифметические (для различных сортов) коэффициенты пересчета меди на пектат кальция: для винограда - 7,0; для яблок - 8,4; для груши, абрикоса, сливы - 7,1; для персика, земляники - 6,5.
В процессе работы выявились и слабые стороны объемного йодометрического метода: необходимость работы с неустойчивыми растворами гипосульфита сантинормальной концентрации, а также субъективный подход при определении конца титрования.
Эти обстоятельства послужили поводом для замены йодометрического метода определения связанной с пектинами меди более объективным и точным - фото- электроколориметрическим.
Колориметрический метод очень удобен в работе, результаты анализа определяют по таблице для любого значения шкалы оптической плотности барабанов ФЭКа.
В зависимости от необходимости коэффициент перевода меди на пектат кальция определяют отдельно для водорастворимой фракции пектинов или для их суммарного выражения.
Анализировать материал можно в свежем виде, а также в навеске, ранее консервированной горячим спиртом (96 ). При этом учитывается, что конечная концентрация спирта, разбавленного навеской, содержащей влагу, не должна быть ниже 80 .
Для работы с виноградом и другими плодово-ягодными культурами наиболее удобно брать навеску в 25 г, на консервирование которой требуется 125 мл спирта (96 ).
Непосредственно перед анализом навеску образца, находящуюся в герметически закрытой колбе, освобождают от спирта и растворенных в ней сахаров, пропуская через бумажный фильтр, затем промывают горячим, спиртом два раза.
Чтобы удалить пары спирта, навеску на фильтре разрыхляют стеклянной палочкой и оставляют на несколько часов для проветривания. С.Я.Райк (1958) рекомендует помещать навеску на два часа в термостат при 90-100 С для более быстрого испарения спирта.
Освобожденную от спирта навеску переносят в первоначальную колбу, запивают 100 мл нагретой до 45 С воды и выдерживают при этой температуре (в термостате или на водяной бане) в течение 30 минут для из» влечения водорастворимой фракции пектинов. Полученную водную вытяжку отфильтровывают в мерную колбу на 250 мл с последующим промыванием остатка на фильтре теплой водой, затем охлаждают, доводят до метки и оставляют для дальнейшего анализа — получения вытяжки гидролизованного протопектина; для этого применяют соляную кислоту и лимоннокислый аммоний.
К навеске, возвращенной вместе с фильтром в экстракционную колбу, добавляют 50 мл соляной кислоты (1/30). Колбу снабжают обратным воздушным холодильником и помещают на 30 минут в кипящую водяную баню. Полученную вытяжку фильтруют также в 200-мл мерною колбе с последующим промыванием фильтра горячей водой. Фильтрование проводят через бумажный фильтр с белой полоской, а при медленном фильтровании - через гигроскопическую вату.
Полученную солянокислую вытяжку нейтрализуют децинормальным раствором едкого натра по лакмусовой бумажке или по изменению розовой окраски. Промытый остаток вместе с фильтром или ватой снова возвращают в экстракционную колбу, заливают 50 мл 1-процентного раствора лимоннокислого аммония и также подвергают получасовой экстракции на кипящей водяной бане.
Полученную вытяжку фильтруют в ту же мерную колбу, где находится нейтрализованная солянокислая вытяжка. Экстракцию лимоннокислым аммонием проводят двукратно по 30 минут. После промывки остатка на фильтре горячей водой содержимое мерной колбы охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.
Для суммарного определения пектиновых веществ водную вытяжку не готовят, а экстракцию навески проводят поочередно соляной кислотой и лимоннокислым аммонием, как описано для протопектина.
Вытяжки водорастворимой фракции пектинов и протопектина подвергают омылению метильных групп. Для этого в химические стаканы на 500 мл пипеткой отбирают по две параллельные пробы каждой вытяжки (точно по 50 мл) и в каждый стакан добавляют по 50 мл децинормального раствора едкого натра.
Процесс омыления проводят, как правило, в течение, ночи. Затем к содержимому каждого стакана добавляют по 50 мл 1 н. раствора уксусной кислоты и через несколько минут по 50 мл 5-процентного раствора сернокислой меди.
Образовавшийся в верхних слоях раствора хлопьевидный осадок выстаивается в течение часа, а затем в холодном виде его отфильтровывают через фильтр с белой полоской. Диаметр фильтра должен быть не менее 11 см, иначе процесс фильтрования слишком затягивается. После количественного перенесения осадка со стакана на фильтр струей горячей воды промывают не только осадок, но и весь фильтр. (Контролем на полноту отмывки ионов меди служит качественная реакция на медь с йодистым калием в кислой среде или на сульфат-ион с помощью раствора хлористого бария)
Отмытые осадки вместе с фильтром снова переносят в те же стаканы, где проводилось омыление, в каждый стакан добавляют 50 мл горячей воды и 8-10 капель концентрированного аммиака. Стаканы прикрывают. Через 15-20 минут, когда полностью растворится осадок, в колбу добавляют 10 мл 2 н. раствора серной кислоты. При этом связанная с пектинами медь вступает в соединение с сульфат-ионом, а пектиновая кислота выпадает в виде студенистого осадка.
Образовавшиеся раствор сульфата меди отфильтровывают от студня в мерную колбу на 100 мл, куда после промывки небольшим количеством воды добавляют 6 мл концентрированного аммиака и до метки - воду (фильтрование лучше проводить через вату).
Образовавшийся в мерной колбе раствор аммиаката меди поступает на фотоэлектроколориметр с установленным красным светофильтром и подготовленными кюветами с рабочей длиной 50 мм.
Для расчетов содержания меди в испытуемых растворах заранее строят калибровочную кривую по химически чистому медному купоросу — CASO4 , 5Н2О.
Стандартный раствор готовят из навески медного купороса 0, 1965 г, растворенной в 500 мл воды. В 1 мл такого раствора содержится 0,1 мг меди. Рабочие растворы готовят в мерных колбах на 100 мл, куда к рассчитанному количеству основного раствора для образования интенсивно окрашенного аммиаката меди добавляют по 6 мл концентрированного аммиака (нами готовились рабочие растворы, содержащие в 1 мл 0,01 мг, 0,02 мг, 0,04 мг, 0,06 мг и 0,08 мг меди).
Калибровочную кривую можно строить по двум способам работы на ФЭКе - по левому и правому барабану, пользуясь красной- шкалой оптической плотности.
Расчет содержания меди в процентах к первоначальной навеске образца производят следующим образом: по величине оптической плотности растворов с помощью калибровочной кривой находят количество мг меди в 1 мл раствора, взятого на ФЭК из мерной колбы на 100 мл. Количество меди в этих 100 мл раствора соответствует пектинам, находящимся в 1/5 части исходной навески образца (25 г), так как из первоначально приготовленной вытяжки 250 мл для дальнейшего анализа использовалось только 50 мл.
Как было указано выше, содержание пектиновых веществ в исследуемом объекте можно сразу найти с помощью заранее рассчитанных таблиц для любого значения оптической плотности, применив найденный для данной культуры коэффициент пересчета меди на пектат кальция или пектиновую кислоту.
