Оценка биохимических методов определения углеводного комплекса

Среди большого разнообразия методов определения сахаров, основанных на их физических и химических свойствах, наибольшего внимания заслуживает метод Бертрана и различные видоизменения его. Метод Бертрана основан на способности сахаров в щелочной среде восстанавливать сернокислую окись меди в закись с учетом последней. Макрометод точен, но очень продолжителен и требует много реактивов и посуды, неэкономичен и не может быть применен при массовых анализах.
В нашем Институте с 1963 г. применяется укороченный метод Бертрана с использованием фотоэлектроколориметра (ФЭК-М) для анализа сахаров у .винограда (лоза, листья и ягоды) и плодовых культур, то есть проводится определение сахаров по обесцвечиванию жидкости Феллинга без учета образовавшейся закиси меди. Предложил этот метод в 1962 г. В Л. Вознесенский. Им было установлено, что степень обесцвечивания анализируемого раствора сахаров после его кипячения с жидкостью Феллинга соответствует содержанию. сахаров в данном растворе.
Нами этот метод детально разработан как метод кассового анализа для винограда, а именно:

1. Проверены показатели белков и других веществ, разрешающих определению сахара (табл.).

Таблица
Влияние применяемых осадителей на точность определения содержания сахара в листьях (сорт Алиготе)

Установлено, что осадительная смесь дает аналогичные результаты со свинцовым осадителем, но процесс осаждения идет значительно легче и быстрее.

1. Проверен режим экстракции сахаров и установлено, что лучшие результаты для растительных образцов можно получить в термостате при 50 С в течение ночи.
2. Установлено, что окраска вытяжек не влияет на точность определения сахаров в образце. Специально проведенные опыты показали, что добавление к образцу некоторого количества глюкозы точно определялось данным методом в окрашенной вытяжке.
3. Построены графики по глюкозе, что дает возможность при постоянной навеске и разведении вычислить таблицы, где по показанию оптической плотности определяется процент сахара.

Определение сахара в сухих растительных образцах винограда. Навеску (листьев 1 г, лозы 1-2 г) берут на торзионных или аналитических весах и помешают в мерную колбу объемом 100 мл, приливают примерно 60 мл воды и колбы для экстракции сахаров ставят на ночь в термостат при температуре 50 С. Утром колбы вынимают из термостата и в них для осаждения белке® и других редуцирующих веществ, мешающих определению сахаров, прибавляют осадительную смесь (10-процентная желтая кровяная соль — раствор N° 1 и 15-процентный сернокислый цинк - раствор Ms 2 берут в равных количествах). Чаще всего для листьев при навеске в 1 г и для лозы при навеске в 2г. Достаточно прибавить по 1,5 мл растворов № 1 и № 2, то есть в сумме 3 мл. Осаждение проводят осторожно. Сначала прибавляют по 1 мл растворов № 1 и № 2, если осаждение неполное (раствор мутный), прибавляют х). Если навеска лозы 1 г, осадителей берут по0,7мп, то есть в сумме 1,4 мл.

Среде по 0,5 мл растворов № 1 и № 2. Затем содержимое колбы дистиллированной водой доводят до метки, хорошо перемешивают, отстаивают и фильтруют через складчатый фильтр. В фильтрате определяют моносахара и сахара после инверсии, то есть полисахариды первого порядка.
Так как количество сахара определяют по уменьшению интенсивности окраски раствора Феллинга, то необходимо соблюдать следующие условия:

1. Точно отмерять количество феллинговой жидкости микробюреткой.
2. Количество раствора и взятой феллинговой жидкости должно быть строго постоянным. В наших условиях мы брали феллинговой жидкости 3 мл и 6 мл испытуемого раствора в сумме 9 мл, при этих условиях составлена калибровочная кривая сахаров на ФЭК-М с применением кювет шириною 10 мм при красном светофильтре.

Определение сахаров до инверсии (моносахара). В три центрифужные пробирки набирают пипеткой или дозатором по 6 мл фильтрата. В опытные пробирки из микробюретки сразу приливают по 3 мл феллинговой жидкости, пробирки встряхивают и ставят в круглый штатив, который помещают в кипящую баню ка 10 минут (считая с момента закипания). Как только пробирки поместили в баню, воду быстро доводят до кипения (кипятят на газовой плите), после чего огонь уменьшают. Если баня с пробирками не сразу закипела, данные анализа будут недостоверны, так как в основе метода Бертрана лежит точное время, когда в теплом состоянии раствор и феллинг находятся в контакте. После 10-мииутного кипячения круглый штатив с пробирками вынимают из кипящей водяной бани и помещают в  сосуд с проточной холодной водой. Охлаждение должно быть быстрым, от. этого зависит точность метода. Далее пробирки центрифугируют (при 3-4 тысячах оборотов в минуту) в течение 10—15 минут, после чего ставят в штатив (колодку), где находятся пробирки с контролем. К контрольным пробиркам с 6 мл фильтрата в каждой приливают по 3 мл феллинга и перемешивают. Образцы готовы к колориметрированию.

Колориметрирование проводят на ФЭК-М при красном светофильтре, используя кювету на 10 мм. Отсчет ведут по левому бара балу по красным делениям шкалы (оптическая плотность). Кюветы с контрольными и опытными растворами помещают в правый канал, причем левый канал все время остается свободным. Делают это следующим образом: в кювету на 10 мм помещают раствор контроля и ставят ее в правый кюветодержатель. При красном светофильтре ставят на нуль левый барабан и вращением оптических клиньев приводят к нулю гальванометр (контроль поставлен на нуль по барабану и по гальванометру). Затем в кювету на 10 мм наливают опытный раствор, осторожно сливают его с осадка закиси меди и ставят снова в правый кюветодержатель (левый канал свободен). Вращают барабан до установления в гальванометре стрелки на нуль и делают отсчет по левому барабану. Затем повторяют это и со второй опытной пробиркой.
Отсчет по красным делениям левого барабана соответствует проценту сахара в анализируемом образце, рассчитанному в таблице на определенную навеску и разведение.
Пример: а) 1 г навески в 100 мл общего объема,
6 мл взято на определение сахара. Показания левого барабана — 0,162, что по таблице соответствует 3,62% сахара;
б)     1 г навески в 100 мл общего объема, на определение сахара взято 3 мл и 3 мл воды; в данном случае процент содержания сахара по таблице умножается на два, так как на определение взято в два раза меньше фильтрата, а именно показания левого барабана -

1. 162. Следовательно,процентное содержание сахара в образце равно 3,62 х 2 = 7.24;  Контроль - фильтрат В мл и 3 мл феллинга, но без кипячения.

в)     2 г навески в 100 мл общего объема, 6 мл взято на определение сахара, так как навеска вдвое больше, то табличные данные процента сахара делятся на два.
Показания левого барабана - 0,162. Процентное содержание сахара в образце равно 3,62:2=1,81.
Сахара после инверсии (моносахара и полисахариды
1-го порядка . В плоскодонную колбочку объемом 100 мл берут 50 мл фильтрата и 2,5 мл 10-процентной хлорной кислоты. Ставят в кипящую водяную баню на 30 минут. Охлаждают и в мерной колбе на 100 мл доводят до метки. Общее разведение (навеска 1 г доведена до объема 100 мл, отсюда взято на инверсию 50. мл, и они доведены до 100 мл; на определение сахара взято 6 мл) в Два раза больше, чем при опрелении моносахаров. Далее все делается так же, как при определении моносахаров.
Определение сахара в виноградных ягодах. Ягоды без семян измельчают в ткане-размельчителе. Берут навеску 25 г. Добавляют примерно 0,5 г мела для нейтрализации свободных кислот и 50-70 мл дистиллированной воды. Проводят часовую экстракцию на водяной бане при 70-80 С. Образец фильтруют в мерную колбу на 250 мл и доводят до метки водой.
В зависимости от степени зрелости ягод для определения сахара с соответствующим осаждением белков берут на разбавление различное количество фильтрата, а именно, если предполагаемое количество сахара~1,5-

1. %, то фильтрата берут 20 мл, если 9-18% - 10 мл, если 19-34% - 5 мл и осаждают белки и дубильные вещества осадительной смесью, прибавляя по 0,25-0,5 мл желтой кровяной соли и сернокислого цинка, после чего доводят объем в мерной колбе до 200 мл. Раствор фильтруют и на определение сахаров берут по 6 мл фильтрата. Определение сахаров проводят так же, как и в сухих образцах.

Для проведения анализа готовят:

1. раствор сернокислой меди (40 г CuSO4 . 5Н2О на один литр воды);
2. раствор сегнетовой соли (200 г CuH4O6KNa .
3. Н2О и 150 г NaОН на один литр воды).

Непосредственно перед их использованием эти растворы смешивают в равных объемах (жидкость феллинга).
Определение полисаридов 2-го порядка. Из методов по определению данных полисахаридов- наибольшего внимания заслуживают определение крахмала по Починку и колориметрический метод определения пектиновых веществ по Мальцеву В.И.
Определение крахмала по  Починку производят двумя методами - колориметрическим и объемным. Методы основаны на растворении крахмала в 80-пропентном растворе азотнокислого кальция, осаждении крахмала из раствора йодом; послe центрифугирования и промывания осадка его или растворяют в щелочи и определяют колориметрически, или окисляют бихроматом (объемный метод).
Колориметрический метод. Берется навеска материала из расчета содержания крахмала 10-100 мг.

Извлечение и растворение крахмала. 1 г тонко измельченного образца виноградной лозы помещают в фарфоровую ступку, растирают с толченым стеклом и 5 мл 80-процентного азотнокислого кальция 20 минут, переносят в коническую колбу на 100 мл и смывают 25 мл 80-процентного раствора азотнокислого кальция, кипятят 3 минуты, остывший раствор количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки и фильтруют.
Осаждение крахмала йодом. В центрифужные пробирки набирают пипеткой 5 мл фильтрата, прибавляют 2 мл 0,5—процентного раствора йода, перемешивают стеклянной палочкой и ставят в холодильник на полчаса. Всю работу с осаждением крахмала и промывкой осадка проводят на холоду (растворы и ротатор от центрифуги охлаждают в холодной камере, опытные пробирки в холодильнике могут быть оставлены и на ночь). Затем центрифугируют при 6000 об/мин.2 часа, если образцы стояли в холодильнике ночь, то - 1- 1,5 часа; прозрачный раствор сливают, а осадок два раза промывают охлажденным 5-процентным раствором азотнокислого кальция с последующим центрифугированием по 10 минут.
Растворение осадка и колориметрирование. В центрифужные пробирки к осадку крахмала прибавляют 5 мл 0,2 % раствора едкого натра, перемешивают и пробирки погружают в кипящую водяную баню на 5 минут. Осадок крахмала растворяется. Раствор переносят в мерную колбу на 100 мл, прибавляют 0,2 мл 0,5-процентного раствора йода (5 г кристаллического йода и 10 г йодистого калия в 1 литре раствора), разбавляют дистиллированной водой, прибавляют 1 м 1г. соляной кислоты, доводят до метки, перемешивают и колориметрируют с красным светофильтром в кювете 5 мл. На нуль гальванометр устанавливают по воде. Опытные образцы помещают в правый канал (в левом-контроль-вода), отсчет производят по правому барабану - красные деления шкалы (оптическая плотность). По показанию оптической плотности находят в таблице (графа 3) процентное содержание крахмала, которое дано на воздушносухую навеску.

Таблица составлена для следующего разведения:
1 г навески доведен до объема 100 мл, на осаждение взято 5 мл. и объем для колориметрирования - 100 мл.

Очистка крахмала, построение кривой. 1 г крахмала (растворимого) при нагревании растворяют в 50 мл 0,2 н.едкого натра, охлаждают. Осадок удаляют центрифугированием. Объем прозрачного раствора замеряют. Добавляют двойное количество этилового спирта. Крахмал выпадает в осадок, ему дают отстояться. Прозрачный раствор сливают. Осадок декантацией 2-3 раза промывают спиртом при центрифугировании. Затем переносят в бюкс и сушат сначала на воздухе, а затем в термостате 2-3 часа при температуре 95 и не выше 100 С.

Объемный метод. Навеску исследуемого вещества берут из расчета содержания крахмала 20-200 мг. Извлечение, растворение и осаждение крахмала проводят так же, как при колориметрическом методе.
Окисление осадка крахмала бихроматом. К промытому осадку в центрифужных пробирках прибавляют 5            мл 0,25 н. раствора бихромата, приготовленного на серной кислоте, перемешивают стеклянной палочкой, затем палочку смывают в пробирку 2 мл воды. Пробирки ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Крахмал окисляется до углекислоты и воды.
Сняв с кипящей бани, пробирки охлаждают и содержимое их количественно переносят 120 мл воды в конические колбы на 250 мл, затем прибавляют 5 мл 20-процентного раствора йодистого калия. Йодистый калий реагирует с избытком бихромата,и выделяется йод, который оттитровывают 0.1 н. гипосульфитом. Контролем служит количество 0,1 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титрование 5 мл бихромата калия (приготовленного на 85-процентной серной кислоте), разбавленного 120 мл воды и 5 мл 20% К J. 1 мл 0,1 н. раствора гипосульфита соответствует 0,675 мг крахмала. Контроль минус опыт соответствует количеству бихромата калия, пошедшего на окисление крахмала.

Расчет проводят по формуле:
% крахмала где,
объем, взятый для осаждения крахмала;
V - объем, в котором растворена навеска;
Р - навеска вещества;
N - коэффициент нормальности гипосульфита;
К - количество гипосульфита, пошедшего на контроль;
ОН - количество гипосульфита, пошедшего на опыт.
Сравнение методов определения крахмала по Починку с анастатическим приводится в таблице 2.
Таблица 2
Результаты анализа лозы сорта Алиготе (% крахмала, данные на сухой вес)

Как видно из таблицы 2, оба метода являются достаточно точными-. Однако колориметрический метод значительно меньше отнимает времени и более удобен в работе. Вычисленные таблицы дают возможность по показанию барабана сразу находить процент крахмала. При колориметрическом методе нет необходимости определять титр гипосульфита, который, как известно, нестоек и требует частой проверки, что значительно усложняет объемный метод и не дает возможности составить таблицы для вычисления процента крахмала по объемному методу.
Реактивы

1. 80-процентный раствор азотнокислого кальция (800 г Са (N03)2 • 4 Н2О + 200 мл воды). Растворение при 45-50°С. В анализ идет охлажденный раствор.
2. 5-процентный раствор азотнокислого кальция.

 Набирают 12,5 мл 80-процентного раствора азотнокислого кальция в мерный цилиндр, разбавляют до 200 мл  и прибавляют 2 мл 0,5-процентного  раствора йода.
Этот раствор готовят на один день работы.

1. 0,5-процентный раствор йода. Отвешивают с точностью до 0,01 г 10 г Кйод и 5г йода, высыпают в ступку и растирают сначала сухую смесь, затем с 10 мл воды переносят в литровую колбу, растворяют и доводят до метки водой.
2. 0,2 н. раствор едкого натра. 8 г едкого натра растворяют в воде и доводят объем до одного литра.
3. 2 н. соляная кислота.
4. 0,25 н. раствор бихромата калия. Отвешивают с точностью до 0,01 г 12,3 г г , растворяют в 250 мл дистиллированной воды в двухлитровой колбе и постепенно при охлаждении приливают 800 мл концентрированной серной кислоты, хорошо перемешивают и после охлаждения переливают в склянку с притертой пробкой.

Определение сахаров по Бертрану по обесцвечиванию жидкости Феллинга
фЭК-М, кювета 10. Красный светофильтр. Анализ растений. Определение редуцирующих сахаров при разведении 1 г - 100 мл - 6 мг»; 6 мл раствора и 3 мл феллинга; сахара после инверсии при разведении: 1 г - 100 мл - 50 мл - 100 мл - 6 мл; 6 мл раствора и 1мл феллинга.

Процент сахаров вычислен на абсолютно сухой вес, влажность воздушносухих образцов принята за 5%.