Определение состава сахаров в почках и побегах методом хроматографии

Метод распределительной хроматографии на бумаге получил широкое распространение в исследовательской работе многих физиолого-биохимических лабораторий, связанных с анализом разнообразного растительного материала.
Нами метод распределительной хроматографии на бумаге применялся для определения динамики состава сахаров в связи с изучением морозостойкости сортов винограда. Поэтому для изучения были взяты пробы осенне-зимне-весеннего отбора ( с августа по март включительно). Исследования проводились начиная с осени 1958 г. Объектами изучения были однолетние побеги восьми сортов винограда, различающиеся по степени морозостойкости. К сортам относительно морозоустойчивым принадлежат Алиготе, Каберне, Фетяска и Совикьон, а к слабоустойчивым - Алеппо, Сенсо и Плавай. Сорт Шасла занимает промежуточное положение.
С 1964 г. для хроматографического анализа отбирались также зимующие почки четырех сортов - Каберне, Фетяски, Алеппо и Плавая.
Для определения состава сахаров в тканях побега и почек применялся в основном метод круговой распределительной хроматографии на бумаге, описанньи А.Н.Бояркиным (1955). В процессе работы в этот метод были внесены некоторые изменения и уточнения с учетом специфических особенностей изучаемого объекта.
Отбор образцов и подготовка материала к определению. Для получения средней пробы побеги определенных сортов винограда нарезают между 6-10 узлами в количестве 10 черенков (по одному черенку с куста ). Кусты, с которых срезают черенки, должны быть нормально развитыми, не пораженными болезнями и вредителями.
Отобранные черенки быстро измельчают ( можно использовать электрофрезу) и фиксируют паром в аппарате Коха. Далее этот материал высушивают при температуре, не превышающей 65-70 С, после чего тща -  тельно измельчают на мельничках типа 'Пируэт' с последующим просеиванием сквозь сито 0,25-0,5 мм.
Навеску сухого фиксированного и измельченного материала в полграмма, помещенную в колбочку на 50 мл, заливают 30 мл спирта (50-60 С колбочки ставят на механическую мешалку для взбалтывания в течение часа.
Экстракцию сахаров мы проводили различными способами: горячим спиртом с взбалтыванием в течение часа, спиртом комнатной температуры с взбалтыванием в течение одного-двух часов, без нагревания и с нагреванием на водяной бане с последующим взбалтыванием. Во всех случаях экстракция проходила без существенных изменений и на хроматограммах проявлялись пятна одних и тех же сахаров с окраской примерно            одной интенсивности. Поэтому мы остановились на экстракции сахаров спиртом комнатной температуры сбалтыванием на механической мешалке в течение часа.

В таком виде (в закрытых чашках Петри) оставляют до начала собственно хроматографического анализа. Отбор почек (в количестве 3-4 г) проводят с тех же ярусов, что и побегов. Срезанные скальпелем почки помещают целиком в пробирки, заливают спиртом и фиксируют в течение пяти минут на водяной бане.
Почки сохраняют в спиртовом экстракте в тех же пробирках, плотно закрытых пробками. Перед анализом почки тщательно растирают в ступке с толченым стеклом и спиртовым экстрактом, количественно переносят в колбочку на 50 мл смыванием новыми порциями спирта (общее количество спирта (60 ) - 30 мл). Колбочки с растертой массой в спирте ставят на механическую мешалку. Весь дальнейший ход подготовки материала аналогичен описанному выше, когда речь шла о побегах.
Подготовка бумаги и камер. Для хроматограмм мы использовали хроматографическую бумагу "Быстрая" Ленинградской бумажной фабрики им. Володарского. Для качественных определений эта бумага вполне подходящая и, как показали наши сравнительные анализы, не нуждается в дополнительной очистке ее муравьиной или соляной кислотой.
Наиболее удобными являются хроматограммы диаметром 17 см, так как на хроматограммах меньшего размера пятна сложных сахаров сближены между со - бой, часто сливаются и располагаются близко к стартовой линии. Стартовую линию и фронт растворения вычерчивают в виде окружностей диаметром 3,5 и 13 см соответственно. Хроматограммы мы делили на 10 секторов, в двух из них наносили "свидетелей", в восьми остальных - экстракты образцов. Для каждого варианта мы получили шесть хроматограмм: по две повторности на каждый из трех применяемых проявителей.
В качестве камер довольно удобны кристаллизационные чашки диаметром 13 см. Пара таких чашек соз- дает камеру, края их должны совпадать. На дно камеры помещают равновеликий круг фильтровальной бумаги. Примерно за час до помещения в камеру хроматограммы ее обильно смачивают растворителем. В камеру помещают небольшой сосудик с растворителем, края его должны быть несколько ниже верха стенки кристаллизационной чашки, чтобы хроматограмма не касалась сосудика. В центр ее вставляют скрученный из хроматографической бумаги фитилек, конец которого опускают в растворитель.
Употребление камер указанного диаметра увеличивает фронт растворения (по сравнению с камерами из чашек Петри) на 3 см и позволяет создавать достаточную насыщенность парами внутреннего пространства камеры.
Нанесение экстракта и разгон его растворителем. Остаток экстракта после выпаривания разводят 1,5 мл спирта (40 ) и этот раствор наносят градуированным капилляром на стартовую линию соответствующего сектора хроматограммы. Накосить можно полоской или в одну точку. Нанесение полоской лучше точечного, однако полоска экстракта не должна быть длиннее 6 мм и шире 2 мм. После каждого нанесения пятно просушивают струей теплого воздуха. Для этой цели удобны фены. Обычно на хроматограмме указанного размера наносят не более 0,005 мл экстракта, так как большие количества не дают четкой картины разделения.
Наиболее употребляемым растворителем является  смесь н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 4: 1:5. При указанных диаметрах, хроматографии и камер в условиях комнатной температу-
ры вполне возможно двухкратное пропускание растворителя в течение одного рабочего дня. Но лучшие результаты получаются при трех- или четырехкратном пропускании. При этом почти все сахара четко разделяются. Исключение составляют глюкоза с галактозой.
Во всех случаях нужно внимательно следить, чтобы фронт растворения всегда оставался одним и тем же, иначе пятна расплываются, сливаются с соседними и образуют "хвосты".
Проявление хроматограмм. Подсушенные при комнатной температуре хроматограммы смачивают ватным тампоном с соответствующим проявителем и вновь подсушивают при той же температуре. Затем проявляют при определенной для каждого проявителя температуре. Мы использовали несколько проявителей на кетозы - реактив с мочевиной (МС), на пентозы и альдозы - ортолуидиновый (ОТС) и на все сахара - анилиндифениламинфосфатный (АДФ). Последний довольно чувствителен и почти универсален. Недостаток АДФ - быстрое потемнение фона проявленных им хроматограмм.
Приготовление и применение проявителей. МС - 0,5 г мочевины растворяют в 45 мл спирта, добавляют 5мл однонормального раствора соляной кислоты. Хроматограммы, обработанные МС, проявляют в течение 5-7 минут при 100 С. Очень четко проявляются пятна фруктозы, сахарозы, рафинозы и стахиозы.
ОТС - 2 г кристаллической салициловой кислоты растворяют з 50 мл спирта, приливают 2,5 мл ортотоллуидина. П|эоявление проходит в течение 6-8 минут при 100-105 С. Проявляются пятна фруктозы, глюкозы с галактозой (неразделенное пятно), мелибиозы, мальтозы, рамнозы, арабинозы, ксилозы, а также неизвестного сахара, идентифицированного Мартой Панчел (1962) как маннинотриоза.
АДФ - смешивают 4-пронентный раствор дифенил - амина в спирте с 4-процентным раствором свежеперегнанного анилина и концентрированной ортофосфорной кислотой в пропорции 5:5:1. Проявление - 7-10 минут при 80 С. Повышение температуры нежелательно, так как вызывает более быстрое потемнение фона. Проявляются почти все сахара.
Анализируя хроматограммы, можно судить не только о составе сахаров, но до некоторой степени и об их количественном содержании. Последнее определяют по величине пятен и интенсивности их окраски и оценивают по пятибалльной шкале: от 1-следы до 5-максимальное содержание. В качестве примера записи оценки в баллах приводим таблицу.
Применяя в своих исследованиях методику определения качественного состава сахаров в том виде, как она здесь представлена, мы получили довольно полное представление о динамике различных форм сахаров и характере их изменений в холодное время года в побегах и почках виноградного растения. Согласно полученным нами за несколько лет экспериментальным данным, в побегах было выявлено девять (включая галактозу) форм сахаров: глюкоза (с галактозой),фруктоза, сахароза, рафиноза, стахиоза, мелибиоза, мальтоза, маннинотриоза (?). Первые четыре сахара наиболее постоянны и количественно лучше представлены в тканях побегов на всем протяжении периода определения. Наиболее ярко эти сахара проявляются в самые холодные месяцы, что в основном согласуется с данными советских и зарубежных ученых. Заметно слабее представлены такие олигосахара, как рафиноза и стахиоза. Довольно явственно они обнаруживаются уже в октябре, но более четко рафиноза и в меньшей степени стахиоза проявляются в последующие холодные месяцы. Особенно слабо на всем протяжении осенне-зимнего периода обнаруживаются мальтоза и мелибиоза.
Помимо вышеуказанных сахаров, преимущественно в холодные месяцы наблюдаются слабые пятна не- идентифицированного нами сахара, который по своему положению на хроматограммах является, по-видимому, маннинотриозой (Марта Панчел, 1962).

Таблица

Состав сахаров в побегах винограда Рислинг Итальянский в динамике с осени 1961 г. до весны 1962 г.

По отдельным годам в связи с различным ходом температуры балльная оценка того или иного сахара в  побегах несколько менялась, хотя общая закономерность динамики состава сахаров оставалась в основном неизменной. Следует отметить, что сортовые различия в составе сахаров, вопреки ожиданию, проявились недостаточно четко.
Состав сахаров различных форм в зимующих почках является аналогичным тому, какой был выявлен в побегах. Но наряду с этим у некоторых сортов были также обнаружены в почках пятна неидентифицированного сахара, занимающего на хроматограммах крайнее к периферии положение.
На основании имеющегося у нас опыта можно с уверенностью сказать, что, пользуясь изложенным методом, можно получить точное представление о качественном составе сахаров в побегах и почках винограда. Кроме этого, анализ хроматограмм дает возможность судить довольно приближенно и о количественном содержании отдельных форм сахаров в различных органах виноградного растения, что в некоторых случаях исследования является вполне достаточные и позволяет обойтись без длительных и сложных количественных определений. Однако совершенно необходимо разработать метод количественного хроматографического анализа сахаров, который по своей точности, простоте и доступности получил бы широкое применение в лабораторной практике.