УДК 634.11: 631.522 : 581.143.6
КУЛЬТУРА IN VITRO ПЫЛЬНИКОВ ЯБЛОНИ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Н.И. Савельев, О.Я. Олейникова
ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, г. Мичуринск
Приводятся результаты изучения андрогенеза in vitro у яблони. Разработана методика массового получения андрогенных каллусных тканей у различных генотипов яблони. У четырех из них к настоящему времени достигнута регенерация растений. Подробно приводятся условия их получения - составы питательных сред, основные параметры физических факторов. Установлено, что наряду с индивидуальными особенностями индукции андрогенных растений яблони существуют и общие для всех генотипов условия успешного осуществления этого процесса.
Плодовые культуры, важнейшей из которых является яблоня, представляют очень трудный материал для селекционно-генетических исследований, т.к. имеют сложную гетерозиготную природу, многолетний цикл развития и не могут репродуцироваться из семян. Использование в работе с ними только традиционных, классических методов, основанных на гибридизации и отборе, не позволяет в полной мере решить проблемы ускорения селекционного процесса и повышения эффективности генетических исследований. Важную роль в их осуществлении может сыграть сочетание классических и современных биотехнологических методов и приемов таких, в частности, как андрогенез in vitro - культивирование на искусственных питательных средах изолированных пыльников и микроспор. В основе этого метода лежит свойство микроспор и клеток пыльцевого зерна в определенных условиях переключаться в своем развитии с характерного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный - путь развития с образованием гаплоидных растений.
В настоящее время андрогенез in vitro - самый быстрый и эффективный способ получения гаплоидных, а на их основе - гомозиготных растений и линий. Он разработан и широко используется в селекции одно- и двулетних сельскохозяйственных культур. Однако для многолетних плодовых растений, в частности яблони, метод массового получения на основе андрогенез in vitro гаплоидных и гомозиготных растений пока не разработан. Только у отдельных ее генотипов получены с небольшой частотой андрогенные новообразования - каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и побеги- регенеранты, среди которых обнаружены гомозиготные, устойчивые к парше удвоенные гаплоиды [1,2]. Немногочисленность исследований андрогенеза in vitro у яблони и ограниченность полученных результатов обусловлены тем, что у плодовых растений андрогенетические процессы (каллусо,-эмбрио,-морфогенез) индуцируются с большим трудом, характеризуются низкой эффективностью, нестабильностью и трудной воспроизводимостью. К тому же, условия получения андрогенных растений-регенерантов, связанные главным образом с подбором селективных компонентов для искусственных питательных сред, приходится подбирать отдельно для каждого генотипа.
Нами на протяжении ряда лет проводится изучение андрогенеза in vitro у различных генотипов яблони. В результате исследований было установлено, что развитие пыльников яблони в условиях in vitro проходит по пути формирования каллусных тканей (непрямой андрогенез); образования эмбриоидов (прямой андрогенез) не отмечено. Была разработана методика массового получения гетерогенных (с клетками различных уровней плоидности - от гаплоидных до полиплоидных) каллусных тканей из пыльников, которая позволяет получать такие каллусы практически у всех генотипов яблони с различной частотой.
У двух сортов - Важак и Либерти - были индуцированы побеги-регенеранты [3, 4]. В целом эти исследования показали, что андрогенез in vitro у яблони - очень сложный, многоступенчатый процесс, состоящий из ряда последовательных этапов - каллусообразовательного, регенерационного, размножения и укоренения. Для успешного осуществления каждого из них требуются свои, конкретные условия, прежде всего, определенный состав питательных сред и оптимальные параметры физических факторов, главными из которых являются свет и температура.
При изучении андрогенеза in vitro у форм яблони с комплексом селекционно- и хозяйственно-ценных признаков: устойчивость к парше (ген Vj), колоннообразный габитус кроны (Со), зимостойкость, было установлено, что средняя частота каллусообразования составляет у них 32 %, а холодовая предобработка пыльников, ранее рекомендованная в пределах 24-72 часов [3], может быть более продолжительной - до 8-10 суток. Не влияя на общий выход андрогенных каллусов, она значительно (в 1,5-2 раза) увеличивает среди них количество морфогенных, которые в последующем способны образовывать органы типа почек, а в отдельных случаях и побеги-регенеранты.
По активности образования андрогенных каллусов все изученные генотипы условно распределены нами в три группы. Первая - с высокой активностью этого процесса (частота каллусообразования более 30 %), в нее вошли такие сорта, как Успенское, Витязь, Былина, Бессемянка, а также колонна 11-7 и гибрид 25-8. Вторая группа - со средней активностью каллусообразования (от 10 до 30%), она включает сорта - Скала, NHOS, Звездочка, Антоновка обыкновенная, колонны 3-19 и 11-62. Третья - с самой низкой частотой каллусообразования (менее 10%) оказалась и самой малочисленной, в нее вошли три генотипа - гибриды 32-37, 12-59 и сорт Ренет Черненко. Больше половины полученных каллусов имели плотную консистенцию, бугристую, с белым опушением поверхность, на свету они быстро зеленели. Такие каллусы считаются морфогенными. Большое их количество (до 80 %) отмечено у сортов Успенское, NHOS, Скала, Витязь, колонна 11-7. Встречались также неморфогенные каллусы - рыхлые, водянистые, бесцветные или серого цвета. От 30 до 50 % таких каллусов имели сорта Звездочка, Антоновка обыкновенная, Пепин шафранный и гибрид 32-37.
С целью индукции в полученных андрогенных каллусах яблони морфогенных образований их пассировали на специальные, так называемые регенерационные, среды с повышенным, по сравнению с ауксинами, содержанием цитокининов. В качестве ауксина использовали главным образом НУК (нафтилуксусная кислота) в концентрации не более 1 мг/л. Цитокининами в наших опытах служили 6-бензиламинопурин (БАП) и кинетин в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг/л.
В результате проведенных исследований впервые была достигнута регенерация побегов в андрогенных каллусах яблони NHOS (с частотой около 30 % от числа полученных каллусов) и Витязь (20 %). Регенеранты были получены следующим образом. Пыльники обеих форм яблони перед посевом на питательные среды проходили предобработку пониженными температурами (+3...+5°С) в течение 8 суток. В качестве базовой на всех этапах получения регенерантов служила среда Мурасиге-Скуга. Инициальной средой, на которой образовались морфогенные каллусы, регенерировавшие впоследствии побеги, у яблони NHOS была среда, включавшая кинетин, ИУК, ИМК, НУК, 2,4-Д по 1 мг/'л, а у сорта Вигязь она содержала (в мг/л): кинетин - 2,0; ИУК - 3,0; 2,4-Д - 0,8; БАП -1,0.
Все пыльники после посева и до образования каллусов культивировали в темноте при температуре 24±2 °С и относительной влажности воздуха 60-70 %, такие параметры температуры и влажности сохранялись и на всех последующих этапах. После образования каллусов их содержали при 16-часовом фотопериоде с освещенностью 1000-1500 люкс (такие световые условия соблюдались и в дальнейшем). Через 7-10 дней полученные каллусы помещали на регенерационные среды. Всего у обеих форм яблони было по три таких пересадки (пассажа) с интервалами между ними в 1,5-2 месяца. Побеги- регенеранты во всех случаях были получены в третьем пассаже. При этом состав питательных сред и последовательность их смены были следующими. У яблони NHOS: 1 пассаж - 1 мг/л НУК, 2 мг/л БАП (среда Р); И - среда та же, Р; III - 1 мг/л НУК, 7 мг/л БАП, 2 мг/л кинетина (Pj) - через 2 месяца каллусы на этой среде образовали побеги-регенеранты. У яблони сорта Витязь регенерация была достигнута таким образом: 1 пассаж - среда Р; II - Pi; III - 1 мг/л НУК, 2 мг/л БАП, 5 мг/л кинетина (Р2) - через 1,5 месяца на этой среде было отмечено появление в каллусах побегов.
Все полученные андрогенные побеги-регенеранты успешно размножались на среде с 1 мг/л ИУК, 2 мг/л БАП, 1 мг/л ГК (коэффициент размножения больше 10). Укоренение побегов достигалось на среде с 2 мг/л ИМК при использовании трехнедельной темновой экспозиции.
Цитологическое изучение части полученных регенерантов показало, что более половины из них - диплоиды, но не исключена возможность наличия среди них удвоенных гаплоидов, это будет выяснено в процессе дальнейших исследований; встречаются также растения с клетками различных уровней плоидности - от гаплоидных до полиплоидных.
Анализ результатов как данных, так и проведенных ранее [3, 4] исследований андрогенеза in vitro у яблони показал, что наряду с индивидуальными имеются и общие для изученных нами генотипов яблони условия получения растений-регенерантов. Так, одинаковыми для всех генотипов являются параметры физических факторов (температурные, световые и др.) культивирования пыльников, каллусов, растений-регенерантов. На этапе индукции побегообразования практически у всех генотипов, образовавших регенеранты, использовались среды с соотношением ауксин: цитокинин, равным 1:2 (Р) и 1:9 (Pi). Большинство используемых регенерационных сред содержали по два цитокинина - БАП и кинетин, концентрация каждого из них, а также последовательность смены сред - индивидуальны для каждого конкретного генотипа.
В целом, проведенные исследования являются определенным этапом на пути создания у плодовых культур на основе андрогенеза in vitro технологии массового получения гаплоидных и гомозиготных растений. Для успешного решения этой задачи дальнейшие исследования будут направлены на изучение механизмов протекания морфо-генетических процессов в андрогенных каллусах и индукции прямого андрогенеза. Гетерогенность андрогенных каллусов может ограничивать в какой-то степени выход гаплоидных растений, в то же время она послужит, в перспективе, источником получения новых, не существующих в природе, но ценных для генетики и селекции генотипов различного уровня плоидности.
Литература
- Hofer М. In vitro androgenesis in apple: Induction regeneration and ploidy Level // Progress in Temperate Fruit Breeding. Klnwer Acad. Publ. - 1994. - P. 99-402.
- Hofer M., Grate C. Erzeugung von haploiden und DH-Material bei Apfel // Erwerbs-Ostbau. - 1999. - B. 41, h. 4. - S. 143-148.
- Жуков O.C., Олейникова О.Я., Савельев Н.И. Методические рекомендации по получению растений-регенерантов плодовых пород в культуре пыльников. - Мичуринск, 1994. - 36 с.
- Савельев Н.И., Олейникова О.Я., Жуков О.С. Андрогенез яблони в культуре in vitro // С.-х. биология. - 1999. - № 3. - С. 48-53.
