Разработка и усовершенствование методов оценки устойчивости винограда к стресс-факторам с использованием культуры in vitro

УДК 634.8:631.537:581.43
РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ВИНОГРАДА К СТРЕСС-ФАКТОРАМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУРЫ IN VITRO
НИ. Зеленянская, Е.И. Ковбасюк, Н.В. Тулинова
Национальный научный центр «Институт виноградарства и виноделия
им. В.Е. Таирова», г. Одесса, игт. Таирово, Украина, iviv nnc@ukr.net.
Приведены результаты исследований по разработке и изучению биотехнологических и биофизических методов определения засухоустойчивости винограда. Для создания стрессовых условий in vitro установлена возможность применения полиэтиленгликоля - ПЕГ.
За последние годы в Украине все чаще проявляются засухи, расширяется их ареал. И несмотря на то, что, с одной стороны, виноград считают засухоустойчивой культурой, с другой - он очень чутко реагирует на наличие влаги и использует ее [1]. Поэтому в регионе Северо-Западного Причерноморья проблема оценки устойчивости винограда к неблагоприятным факторам среды, и особенно засухе, является актуальной. Основным критерием оценки устойчивости винограда к экстремальным условиям является продуктивность [2]. Но виноград вступает в плодоношение только на 3-4 год после посадки и это усложняет работу, т.к. для характеристики ценных исходных форм желательно получать такую оценку на начальных этапах работы. Для этого целесообразно использовать биофизические методы и методы культуры тканей in vitro, которые позволяют получать результат на протяжении года.
Целью наших исследований была разработка и изучение экспресс-методов определения засухоустойчивости винограда в культуре тканей in vitro.
Работу проводили в отделе питомниководства и размножения винограда на микроклонах винограда сортов Шардоне 4876 и Мускат гамбургский 2034. Засуху создавали путем добавления в питательную среду МС (Мурасиге и Скуга) и ионообменный субстрат Биону осмотически-активного вещества — полиэтиленгликоля (ПЕГ). Концентрация последнего составляла 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0; 5,0 и 6,0 %. Микроклоны контрольных вариантов культивировали на питательных средах без ПЕГ. На стрессовые среды МС+Г1ЕГ пересаживали микроклоны с хорошо развитой корневой системой и одноглазковые черенки. Для определения физиологического состояния микроклонов винограда проводили определение содержания общей и легкоудерживаемой воды в тканях листьев и побегов [3], содержания пигментов [3], индукции флуоресценции хлорофилла (при помощи портативного хронофлуорометра «Флоратест»). Определяли сроки пролиферации пазушных почек, ризогенеза одноглазковых черенков, изменение высоты растений, количества листьев и междоузлий перед посадкой на стрессовую среду и после окончания исследований.
На первом этапе исследований на стрессовые среды (МС, Биона) высаживали одноглазковые черенки. Учет их приживаемости на 20-й, и особенно на 30-й день показал, что в контрольных вариантах этот показатель был самым высоким и составлял 88,0-90,0 %. В опытных вариантах, в зависимости от концентрации ПЕГ и сорта, таких черенков было меньше. Так, на 30-й день исследований количество черенков (среднее по сортам), которые прижились на среде с 2,0 % концентрацией ПЕГ, составляло 70,0-79,0 %, в вариантах с 4,0 % ПЕГ - 65,0-77,0 %. Приживание черенков на средах с 5 и 6 % концентрацией ПЕГ было наименьшим и составляло 54,0-64,0%. В вариантах с высокими концентрациями ПЕГ было и наименьшее количество черенков, у которых развивались пазушная почка и корни: 22,0 % (3,0 % ПЕГ), 19,0 % (4,0 % ПЕГ), 17,0 % (5,0 % ПЕГ) и 9,0% (6,0 % ПЕГ). Между контрольными вариантами и вариантами с низким содержанием ПЕГ в МС и Бионе достоверной разницы не было. Следует отметить, что через 45-50 дней наблюдений черенки, которые культивировали на пита- тельной среде МС и субстрате Биона с ПЕГ 5,0 и 6,0 %, погибали, поэтому в дальнейшие исследования эти варианты не включали.
На втором этапе исследований на питательные среды (МС+ПЕГ 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 и 4,0 %) высаживали уже укорененные растения высотой 5-7 см. На протяжении первых 5-7 дней микроклоны сортов Шардоне 4876 и Мускат гамбургский 2034 в опытных вариантах с высокими концентрациями ПЕГ (3,0-4,0 %) отличались снижением тургора в листьях и побегах, а через 14-15 дней были четко выраженные признаки осмотического шока - усыхание и скручивание верхушек побегов и листьев (рис. 1).

1  - часть усыхающего прироста
Рие. 1. Микроклоны винограда сорта Мускат Гамбургский 2034 на питательной среде МС с добавлением ПЕГ 3,0 % концентрации
За счет усыхания апикальной части растения у микроклонов опытных вариантов уменьшалась высота, количество листьев и междуузлиев. Контрольные растения наоборот, отличались увеличением этих показателей, что свидетельствует об активных ростовых процессах (таблица). Так, по сравнению с начальными данными, через 15 дней после пересадки микроклонов изучаемых сортов на среду МС с содержанием ПЕГ 2,0-4,0 % наблюдали уменьшение высоты растений от 6,0 % до 43,0 %, количества листьев - на 23,0-57,0 %. У растений контрольных вариантов эти показатели увеличивались на 21,0 % (высота растений) и 18,0 % (количество листьев). Подобные результаты развития микроклонов были получены на субстрате Биона. Добавление ПЕГ к питательной среде и субстрату способствовало развитию в тканях листьев, побегов микроклонов водного дефицита и перераспределению фракций воды.
Таблица
Показатели роста и развития микроклонов   Шардоне 4876 на стрессовой среде МС       

Наилучшими показателями водного режима листьев характеризовались микроклоны изучаемых сортов в контрольных вариантах: количество общей воды составляло 87,0 %, легкоудерживаемой воды - 69,0 %. В опытных вариантах (МС, Биона) с концентрацией ПЕГ 3,0 и 4,0 % эти показатели были на уровне 42,0-48,0 % (легкоудерживаемая вода) и 75,0-78,0 % (общая вода). По показателям водного режима побегов между контрольными и опытными вариантами достоверной разницы не было (рис. 2).
% Шардоне 4876                              Мускат гамбургский 2034

Рис. 2. Влияние разных концентраций ПЕГ на показатели водного режима прироста микроклонов винограда сорта Шардоне 4876
Определение ИФХ листьев микроклонов обоих сортов в вариантах с ПЕГ 3,0 и 4,0 % показало, что по сравнению с контролем, значение кривой ИФХ в максимуме увеличивалось, кривая позже (по времени) выходила на стационарный уровень. Это свидетельствует о том, что большая часть поглощенной световой энергии высвечивалась в виде флуоресценции, фиксация углекислоты и синтез органических веществ начинались позже, в результате снижалась интенсивность фотосинтеза (рис. 3). Этот факт можно расценивать как ответную реакцию микроклонов на действие модельной засухи, а названные показатели использовать как критерий оценки на засухоустойчивость.

Рис. 3. Влияние ПЕГ на изменение ИФХ листьев микроклонов винограда Мускат гамбургский 2034:
а - через 5 дней после пересадки на стрессовую среду; б - через 15 дней
Таким образом, моделирование стрессовых условий в культуре тканей in vitro с применением ПЕГ целесообразною применять для определения устойчивости винограда к засухе, а ИФХ использовать как диагностический критерий.
Литература

1. Физиология винограда и основы его возделывания / Под рук. и ред. К. Стоева - Т.З - София. Изд-во Болгарской академии наук, 1984. - 328 с.
2. Кондо, И.Н. Устойчивость виноградного растения к морозам, засухе и почвенному засолению /И.Н. Кондо. - Кишинев: Картя Молдовеняске, 1970. - 96 с.
3. Практикум по физиологии растений /И.Н. Третьяков [и др.]. - М.; Агропромиздат, 1990.

По материалам Международной научно-практической конференции "Научно-прикладные аспекты развития виноградарства и виноделия на современном этапе" - Новочеркасск, ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, 2009