Идентификация клонов востребованных белых технических сортов

Идентификация клонов востребованных белых технических сортов винограда методами классической селекции и ДНК-маркирования

Идентификация клонов востребованных белых технических сортов винограда методами классической селекции и ДНК-маркирования
Е.Т. ИЛЬНИЦКАЯ, канд. биол. наук; В.С. ПЕТРОВ, д-р с.-х. наук;
И.И. СУПРУН, канд. биол. наук; Т.А. НУДЬГА; М.А. СУНДЫРЕВА; Е.А. ДАУРОВА, канд. техн. наук Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства
Ключевые слова: виноград, клоновая селекция, протоклоны, ДНК-маркеры Keywords: vine, clonalselection, protoclone, DNAmarkers

Краснодарский край — главный виноградопроизводящий и винодельческий регион России.

Формирование оптимального сортимента ставит своей целью наиболее полную реализацию генетического потенциала сорта при максимальном использование почвенно-климатических ресурсов зоны возделывания. Клоновая селекция устраняет недостатки, снижающие общую оценку сорта (низкая урожайность, мелкие грозди, горошение ягод и др.), обеспечивает отбор кустов (клонов) винограда с самыми высокими хозяйственно-ценными признаками (урожайность и качество, сроки созревания, устойчивость к вредным организмам, адаптивность в стрессовых условиях природной среды и др.) [1]. Лучшие адаптивные свойства и продукционный потенциал клонов проявляется, как правило, в природных почвенно-климатических условиях мест их выделения. Следовательно, необходимо развивать отечественную клоновую селекцию и пополнять сортимент клонами, адаптированными к условиям зон основного размещения российских виноградников.
Около 60% виноградников края сосредоточено в Темрюкском районе, примерно половина из которых — классические европейские сорта для высококачественного виноделия. Эти насаждения до сих пор не были охвачены планомерной и масштабной клоновой селекцией, поэтому массовая клоновая селекция на них в данной сельскохозяйственной зоне имеет особое значение.

Цель работы — идентификация высокопродуктивных клонов винограда районированных сортов Шардоне и Алиготе, адаптированных к условиям Таманской зоны, методами классической клоновой селекции с привлечением технологии ДНК- маркирования.
Работу проводили на промышленных виноградниках АФ «Южная», «Мирный» и «Фанагория-Агро». Изучаемые насаждения представлены очень неравноценными кустами по урожаю и его качеству: насаждения Шардоне в АФ «Мирный» 1997 г. посадки и в отделении «Залив» АФ «Южная» занимают по 10 га; Алиготе в отделении «Залив» АФ «Южная» расположен на 16 га, а в АФ «Фанагория-Агро» 1983 г. посадки — на 14 га. На участках поддерживается высокий агрофон.
Исследования проводили по общепринятым в виноградарстве методикам массовой и клоновой селекции [2, 3]. Кандидатов в клоны отбирали на основании стабильности плодоношения, повышенной морозоустойчивости и хорошего фитосанитарного состояния, проявлявшихся ежегодно в 2005-2011 гг. За этот срок по положительным признакам выделено 113 протоклонов Шардоне, 125 протоклонов Алиготе. Следует отметить, что в январе 2006 г. наблюдались экстремально низкие температуры, и условия зимы 2010 г. были крайне неблагоприятны для винограда, что позволило определить наиболее адаптированные к низкотемпературному стрессу растения. Отобранные протоклоны по внешним признакам свободны от хронических болезней, обладают повышенной устойчивостью к морозам, вредителям и грибным болезням.
В основной массе выделенные кусты отличаются более высокими показателями продуктивности побегов, коэффициентов плодоношения, урожайности по сравнению с контролем (средние кусты исходного сорта) (см. таблицу, средние данные за 2009-2011 гг.).

Результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации локуса WMD32: М — маркер молекулярного веса pBR322/BsuR1; Ш — сорт Шардоне, 1-9 — протоклоны

Из урожая ряда отобранных кустов протоклонов методом микровиноделия готовили опытные образцы вин, провели их органолептическую и дегустационную оценку: вино из них было хорошего и высокого качества.
Протоклоны размножили для оценки их по вегетативному потомству на клоноиспытательном участке, что позволило выделить лучшие образцы. Параллельно изучали протоклоны методами молекулярного маркирования.
В настоящее время ДНК-маркеры широко применяют при оценке генетического разнообразия, классификации и паспортизации сортов. Для идентификации сортов винограда наиболее часто используют маркерные системы, основанные на вариабельности микросателлитных участков ДНК. Микросателлитный анализ (SSR-ана- лиз) также дает возможность оценивать степень генетического родства клонов между собой и исходным сортом винограда. Результаты ряда работ по идентификации клонов винограда показывают, что определенный набор маркеров может давать разную информативность на отдельных сортах, то есть для некоторых групп сортов могут выявляться индивидуальные оптимальные наборы маркеров, позволяющие проводить идентификацию. Так, для европейского проекта по генресурсам винограда (http://www.genres.de/vitis/) были выбраны нейтральные маркеры VVS2, VVMD5, VVMD7, ssrVrZAG47, ssrVrZAG62, ssrVrZAG79 благодаря их высокой распознавательной способности. Исследования F. Pelsy и др. показали эффективность микросателлитных маркеров VMC3a9, VMC5g7, VVS2, VVMD30 и VVMD32 в выявлении полиморфизма клонов [4]. Мы выбрали эти маркеры для изучения генотипов протоклонов и сравнения ДНК-профилей исходных сортов и кустов — кандидатов в клоны.
Из молодых листьев апикальной части побегов протоклонов выделяли образцы ДНК. Экстракцию ДНК проводили ЦТАБ- методом [5] с 1%-ным поливинилпирролидоном в экстрагирующем буфере. При проведении микросателлитного анализа столкнулись с проблемой качества ПЦР- продукта вплоть до его полного отсутствия при реакциях с ДНК ряда образцов. При этом выявляли высокую концентрацию ДНК в выделенных образцах генетического материала. Варьирование параметров реакции не давало видимых улучшений, на основании чего был сделан вывод о присутствии ингибиторов ПЦР в пробах ДНК (полифенольные соединения). Для очистки проб использовали микроколонки с набором реагентов для очистки ДНК KR-011 (ООО «Омникс», Санкт-Петербург).
ПЦР проводили в стандартных условиях, экспериментально подобрав температуру отжига праймеров для каждого маркера. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР осуществляли в 8%-ном полиакриламидном геле на основе трис- боратного буфера. Визуально находили амплифицированные фрагменты ДНК в УФ-свете, предварительно окрашивая гелевые пластины раствором бромистого этидия.
В настоящее время апробируем указанные маркеры, оптимизируем экспериментальные параметры ПЦР-анализа, изучаем ряд протоклонов по локусам VVS2, VVMD5, VVMD32 (см. рисунок).
Совместное применение традиционных подходов и методов молекулярного анализа позволяет ожидать большую эффективность в работе по идентификации клонов. Будут созданы ДНК-профили протоклонов и типичных кустов изучаемых сортов с целью их сравнения друг с другом для выявления генетических различий и определения оптимально информативного набора маркеров для идентификации клонов. С 2011 г. работу выполняют при финансовой поддержке РФФИ и региональных инвесторов: проект № 11-04-96538-р_юг_ц.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Егоров Е.А. Обеспечение устойчивого производства винограда на основе создания современного питомниководства/Е.А. Егоров, В.С. Петров, М.И. Панкин, Г.В. Олешко//Виноделие и виноградарство. 2009. №3. С. 4-7.
2. Технологии производства элитного посадочного материала и виноградной продукции, отбора лучших протоклонов винограда. — Краснодар: ООО РИА «АлВи-Дизайн», 2005. 256 с.
3. Трошин, Л.П. Ампелография и селекция винограда/Л.П. Трошин. — Краснодар, 1999.138 с.
4. Pelsy, F. An extensive study of the genetic diversity within seven French wine grape variety collections/F. Pelsy, S. Hocquigny, X. Moncada et al.//Theor Appl Genet., 2010. P 1219-1231.
5. Rogers, S. О. & A.J. Bendich Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues/S. 0. Rogers & A. J. //Plant Molecular Biology. 1985. P. 69-76.