Подходы в области клеточной биологии и генетической инженерии для улучшения характеристик сортов

УДК
Волынкин Владимир Александрович, д.с.-х.н., профессор, гл. н.с. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии, volynkin@ukr.net;
Лиховской Владимир Владимирович, к.с.-х.н., нач. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии, lihovskoy@gmail.com;
Олейников Николай Петрович, к.с.-х.н.,с.н.с., в.н.с. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии, oleinikov1@rambler.ru;
Павлова Ирина Александровна, к.б.н., с.н.с., и.о. зав. сектором клоновой селекции и размножения винограда, pavlovairina1965@gmail.com;
Левченко Светлана Валентиновна, к.с.-х.н.,с.н.с., с.н.с. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии, svelevchenko@rambler.ru;
Зленко Валерий Анатольевич, к.с.-х.н., с.н.с. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии, select_magarach@ukr.net
Васылык Ирина Александровна, к.с.-х.н., н.с. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии, kalimera@inbox.ru
Национальный институт винограда и вина „Магарач”, Ялта, ул. Кирова, 31. select_magarach@ukr.net
Шелудько Юрий Всеволодович, к.б.н., зав. лаб. систем биосинтеза природных соединений отдела генетической инженерии, ysheludko@ukr.net
Герасименко Ирина Михайловна, к.б.н., н.с. лаб. систем биосинтеза природных соединений отдела генетической инженерии, i-gerasimenko@ukr.net
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Украина, г. Киев, ул. Заболотного 148, info@icbge.org.ua

Классические и инновационные подходы в области клеточной биологии и генетической инженерии для улучшения характеристик сортов винограда

Резюме: Перманентное изменение состояния биосферы обусловливает  необходимость постоянного сортообновления, а создание сортов отвечающих этим  условиям не всегда возможно традиционным методом генеративной гибридизации. Рассматриваются пути и способы формирования нового генотипа винограда биотехнологическими методами с использованием классических и инновационных подходов в области клеточной биологии и генной инженерии, обсуждаются предварительные результаты исследований. 
 Ключевые слова: генетически модифицированные растения, вирусные болезни, бактериальные рак винограда, трансгенные линии, капсидный белок, сомаклональная изменчивость.

Volynkin Vladimir Aleksandrovich, Dr. Agric. Sci., Professor, Chief Staff of the Department of Plant Breeding, genetics grapes and Ampelography.
Lichovsky Vladimir Vladimirovich, Cand. Agric. Sci., Head of the Department of Plant Breeding, genetics grapes and Ampelography.
Olejnikov Nicolai Petrovich, Cand. Agric. Sci., Senior Reseacher, Leading Reseacher of the Department of Plant Breeding, genetics grapes and Ampelography.
Pavlova Irina Aleksandrovna, Cand. Biol. Sci., Senior Reseacher, Acting Head of sectorof clonal selection
Levchenko Svetlana Valentinovna, Agric. Sci., Senior Reseacher, Senior Reseacher of the Department of Plant Breeding, genetics grapes and Ampelography.
Vasylyk Irina Aleksandrovna, Cand. Agric. Sci., Reseacher of the Department of Plant Breeding, genetics grapes and Ampelography.
National Institute for Vine and Wine Magarach,31 Kirov St., Yalta, Republic of the Crimea,
Sheludko Yuriy Vsevolodovich, Cand. Biol. Sci., Head of Laboratory of Natural Product Biosynthesis Systems of the Department of Genetic Engineering, ysheludko@ukr.net
Gerasymenko Iryna Mykhajlivna, Cand. Biol. Sci Sci. Reseacher of Laboratory of Natural Product Biosynthesis Systems of the Department of Genetic Engineering, i-gerasimenko@ukr.net
Institute of Cell Biology and Genetic Engineering NAS of Ukraine, 148 Zabolotnogo St. Kiev, Ukraine, info@icbge.org.ua

Classical and Innovative Approaches in Cell Biology and Genetic Engineering for Grapevine Cultivar Characteristic Improvement 

Abstract: Current global biosphere changes generate necessity for continuous renewal of horticulture plant varieties. Application of traditional generative hybridization approaches not always guarantee creation of new cultivars satisfying the novel requirements. Here we consider ways and approaches for formation of new grapevine genotypes using classical and innovative protocols of cell biology and genetic engineering; preliminary results of researches are discussed. 
 Key words: genetically modified plants, viral disease, grapevine crown gall disease, transgenic plants, capsid protein, somaclonal variety.

Использование современных биотехнологических подходов для обеспечения устойчивости ценных сельскохозяйственных растений к патогенам является одной из актуальнейших задач биологии на данный момент, решение которой может способствовать обеспечению продовольственной безопасности в мире в условиях развивающихся климатических изменений, а также снижению нагрузки на экосистемы, обусловленной масштабным использованием пестицидов. Исследование молекулярных и биохимических механизмов такой устойчивости создаёт информационную базу, позволяющую получать растительные организмы с минимальными необходимыми изменениями и сохранением всех ценных признаков, что, в свою очередь, обеспечивает экономическую выгоду для фермеров и сельскохозяйственных компаний. Применение генетически-модифицированных растений, устойчивых к заболеваниям и вредителям, снизило в течение 10 лет необходимость обработки пестицидами в 3-6 раз, и, на примере хлопка, обеспечило в течение трёх лет  прирост прибыли для фермеров разных стран на 12-340 %. По данным ФАО за 2001 г. использование сои, устойчивой к гербициду раундап, за счёт уменьшения себестоимости продукции вызвало прирост общей прибыли на 53 %  [1]. Таким образом, экономическая выгода от создания резистентных к патогенам линий растений может составлять около 10-20 %  в первые 5 лет после начала использования.
Виноград является одной из базовых сельскохозяйственных культур крымского полуострова, обеспечивающей около половины продукции пищевой промышленности Крыма. В этой связи чрезвычайно актуальным является вопрос снижения потерь урожая виноградников в результате воздействия патогенов, часто связанных с сезонными климатическими особенностями. Так, например, распространённый в Крыму вирус золотистого пожелтения винограда (в случае эпифитотии) может привести к потере 20—30% урожая. Вирусная болезнь, вызываемая вирусом вееролистности винограда (GFLV), по данным Fuchs M. и Gonsalves D. (2007), поражает во Франции до 60% посадок винограда и наносит ущерб около $ 1 миллиарда ежегодно [2]. Борьба с этими заболеваниями направлена на уничтожение переносчиков и патогенов  и требует регулярного масштабного применения инсектицидов и фунгицидов, наряду с профилактической обработкой почв и саженцев.
Другой опасной болезнью является рак винограда, вызываемый Agrobacterium vitis. Данная болезнь была зарегистрирована во многих регионах, включая Китай, Японию, Южную Африку, Европу, Российскую Федерацию и американский континент [3], и считается наиболее важной бактериальной болезнью винограда [4]. Рак винограда вызывается почвенной бактерией Agrobacterium vitis, способной переносить часть своего генетического материала в клетки растения и встраивать в геном. В результате экспрессии бактериальных генов изменяется гормональный баланс растительных клеток, и происходит неконтролируемый рост опухолеобразной ткани, что, в конечном итоге, приводит к некрозам и угнетению роста и плодоношения.  Опухоль часто развивается в районе прививки, может индуцироваться заморозками или механическими повреждениями. При интенсивном развитии болезнь вызывает к четвёртому году уменьшение урожая ягод и интенсивности роста лозы на 40% по сравнению с неповреждёнными растениями [5].
Детальные биохимические и генетические исследования, проведённые с Agrobacterum vitis, показали, что за опухолеобразование отвечают продукты двух генов, участвующих в биосинтезе ауксинов (iaaH, iaaM) и гена, участвующего в биосинтезе цитокининов (ipt). Также был выделен ген, отвечающий за некрозы тканей (pehA) [6].
У вирусных инфекций и бактериального рака есть общая черта, позволяющая использовать одинаковые подходы для создания устойчивых к этим заболеваниям линий растений. В обоих случаях генетический материал патогенов попадает в клетку и экспрессируется с участием внутриклеточных ферментативных комплексов. Нарушение в цепи переноса информации ДНК(РНК)-мРНК-белок будет блокировать развитие инфекции и обеспечит устойчивость организма к данным патогенам.
Одним из наиболее эффективных на данный момент способов блокирования вирусных инфекций в растениях является индукция замолкания вирусных генов с помощью собственных растительных защитных систем. Наиболее успешной стратегией получения трансгенных растений, устойчивых к вирусам, является патоген-опосредованная устойчивость (pathogen-derived resistance). В основе метода лежит перенос в геном растения фрагментов генома вируса. Чаще всего используются гены капсидных белков, а также гены репликаз, протеиназ и транспортных белков. Хотя механизмы, проводящие к развитию вирусоустойчивости вследствие переноса вирусных генов в растения, до конца не известны, предполагается, что в большинстве случаев патоген-опосредованная устойчивость развивается с участием РНК-опосредованной интерференции [7].
Центральную роль в запуске РНК-опосредованной интерференции играют короткие молекулы РНК (микроРНК или короткие интерферирующие РНК), которые образуются из двухцепочечных РНК-предшественников. Основой для синтеза коротких РНК могут служить как двухцепочечные РНК-геномы вирусов, так и одноцепочечные РНК, кодируемые растительным геномом и способные к образованию частично двухцепочечных шпилечных структур. Также вторая цепь может достраиваться к одноцепочечным вирусным геномным РНК и чужеродным транскриптам с помощью растительных РНК-зависимых РНК-полимераз [8]. Образованные короткие РНК связываются с белковыми комплексами, способными подавлять экспрессию генов на разных уровнях, и служат адаптерами, направляющими инактивирующие комплексы на комплементарные последовательности нуклеиновых кислот. В результате наблюдается замолкание соответствующих генов на пост-транскрипционном уровне (подавление трансляции или разрушение РНК) или ингибирование транскрипции [9].
Первое поколение трансгенных растений, демонстрирующих патоген-опосредованную вирусоустойчивость, было получено путем переноса способных к трансляции вирусных генов. В настоящее время некоторые из этих сортов присутствуют на рынке. Сорт тыквы CZW-3 (Asgrow Seed Co.), экспрессирующий гены капсидных белков вирусов желтой мозаики цуккини, мозаики арбуза и огурца, демонстрирует устойчивость к этим трем вирусам и допущен к использованию в США и Канаде [10]. Наибольший коммерческий успех имели сорта папайи, устойчивые к вирусу кольцевой пятнистости благодаря экспрессии гена капсидного белка этого вируса. Использование устойчивых сортов Rainbow и SunUp способствовало  восстановлению продукции папайи на Гавайских островах в 90х годах прошлого века после того, как распространение вируса кольцевой пятнистости папайи привело эту отрасль хозяйства на грань банкротства. Недостатком использования нативных вирусных генов является значительная гетерогенность трансгенных линий по уровню устойчивости. Вероятно, это связано с необходимостью участия растительных РНК-зависимых РНК-полимераз в образовании двухцепочечных предшественников коротких РНК. В дальнейшем подход был усовершенствован путем введения в растительный геном последовательностей, кодирующих нетранслируемые молекулы РНК, имеющие шпилечную структуру и непосредственно служащие субстратом для синтеза миРНК [11]. Такие последовательности могут быть размещены в интронах белок-кодирующих генов [12]. Таким методом были получены трансгенные растения многих видов, устойчивые к различным вирусам [13].
Короткие РНК могут использоваться и для создания растений, устойчивых к патогенам других систематических групп. Экспрессия в растениях шпилечной РНК, гомологичной гену секретируемого белка нематоды, привела к значительному увеличению устойчивости [14]. Были предприняты попытки синтезировать в растениях миРНК, направленные против генов фитопатогенных грибов. Хотя было показано, что это приводит к снижению уровня транскрипции соответствующих генов гриба, не наблюдали значительного повышения устойчивости растений [15].
Перенос в растительную клетку Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens также приводит к образованию коротких интерферирующих РНК [16], что подтверждает роль РНК-опосредованного замолкания генов в развитии устойчивости к агробактериальным заболеваниям. Было показано, что предварительная обработка растений винограда непатогенными штаммами агробактерий приводит к развитию устойчивости к последующему заражению патогенными штаммами [3]. Возможно, в основе этого явления лежит замолкание генов фитопатогенного штамма, обусловленное короткими РНК, синтезированными на основе транскриптов непатогенных штаммов. Подавление экспрессии различных генов A. vitis в трансгенных растениях винограда позволит уточнить их роль в развитии опухолей. В недавней публикации показана перспективность использования РНК-опосредованного замолкания генов в развитии устойчивости  винограда к  Agrobacterium [17]. После трансформации винограда последовательностями, индуцирующими замолкание генов и гомологичными участкам онкогенов iaaM и ipt плазмиды pTiA6 были получены линии растений, устойчивость которых к даному штамму бактерии коррелировала с уровнем экспрессии трансгена, хотя авторы отмечают отсутствие устойчивости к другим штаммам.
Использование целевого введения отдельных генов, отвечающих за устойчивость к неблагоприятным факторам и патогенам, в растительные клетки позволит, с одной стороны, исследовать физиолого-биохимические особенности гетерологической экспрессии трансгенов, с другой - создать линии винограда классических сортов с улучшенными свойствами, сохраняющие все особенности сорта и несущие новые хозяйственно-ценные признаки. Данный метод исключает необходимость проведения отдалённой гибридизации и последующих стадий возвратного скрещивания, сопряжённые с риском потери или изменения сортовых характеристик и занимающих продолжительное время. В настоящий момент разработка и полевые испытания генетически модифицированных линий винограда активно проводятся в странах с развитым  виноградарством, таких как США, Австралия, Италия, Канада, Германия и Чили [18]. Полевые испытания чилийского Института сельскохозяйственных исследований (Chilean Institute for Agricultural Research (Santiago)) включают тестирование около 700 трансгенных линий винограда.
Ключевым моментом для проведения генетической трансформации винограда является получение эмбриогенной клеточной линии и разработка протокола регенерации полноценных растений. Несмотря на то, что первые успешные протоколы соматического эмбриогенеза винограда были опубликованы ещё в середине 70-х годов прошлого века [19, 20], получение стабильной эмбриогенной клеточной культуры остаётся непростой задачей, требующей индивидуального подхода к каждому сорту, а также внутрисортовым вариантам [21]. Тем не менее, в результате экспериментального подбора концентраций фитогормонов, витаминов и минеральных веществ в питательной среде можно получить оптимальную комбинацию, обеспечивающую эффективный эмбриогенез и последующую регенерацию растений. Важным аспектом при этом является выбор исходной эмбриогенной ткани, в качестве которой чаще всего используют пыльники разной степени созревания, соцветия, листовые экспланты, междоузлия и некоторые другие типы тканей. Полученные культуры могут быть использованы как источники для регенерации генетически-модифицированных растений, селекционных работ с использованием спонтанной или индуцированной сомаклональной изменчивости [22], а также  получения свободных от вирусов растений [23] или гипокотильных эксплантов, используемых в качестве подвоя [24]. Необходимо заметить, что сочетание трансгенного подвоя и нетрансгенного привоя в некоторых случаях позволяло контролировать распространение болезни в целом растении, как это было описано для экспрессии антимикробных белков, обеспечивающих устойчивость к болезни Пирса и распространяющихся по ксилеме [25]. Элитный привой в этом случае сохраняет свою генетическую уникальность и не несёт чужеродных генов. В ряде стран возможности использования таких прививок в сельском хозяйстве рассматриваются по упрощённой процедуре, по сравнению с генетически-модифицированными растениями.
Таким образом, современная биотехнология предлагает комплекс классических и инновационных подходов в области клеточной биологии, молекулярного клонирования и генетической инженерии, реализация которых позволит получить уникальную информацию в области физиологии взаимодействия растения и патогена, обеспечения системной устойчивости к патогену при сохранении генетической идентичности привоя, а также создать коллекцию эмбриогенных клеточных культур и трансгенных линий растений, устойчивых к вирусным и бактериальным заболеваниям, перспективных сортов винограда Крыма.

1. The state of Food and Agriculture 2003-04.  FAO Agriculture Series ; № 35, - Rome : Food and Agriculture organization of the united nations, 2004. - 212 p.
2. Fuchs, M. , Gonsalves, D. 2007. Safety of virus-resistant plants two decades after their introduction: Lessons from realistic field risk assessment studies. Annual Review of Phytopathology 45, 173-202
3. Burr TJ, Bazzi C, Süle S, Otten L (1998) Biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Disease 82:1288-1297.
4. Pearson, R., and Goheen, A. 1988. Compendium of Grape Diseases. APS Press, St. Paul, Minnesota. – 121p.
5. Schroth, M.N., McCain, A.H., Foott, J.H., and O.C. Huisman (1988). Reduction in yield and vigor of grapevine caused by crown gall disease. Plant Disease 72, 241-246
6. Herlache, T. C., Hotchkiss, A. T., Burr, T. J., and Collmer, A. 1997. Characterization of the Agrobacterium vitis pehA gene and comparison of the encoded polygalacturonase with the homologous enzymes from Erwinia carotovora and Pseudomonas (Burkholderia) solanacearum. Appl. Environ. Microbiol. 63:338-346.
7. C. Simón-Mateo and J.A. García (2011) Antiviral strategies in plants based on RNA silencing. Biochim. Biophys. Acta 1809, 722-731.
8. Tang, G., Reinhart, B. J., Bartel, D. P., & Zamore, P. D. (2003). A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes & Development, 17(1), 49–63.
9. Matzke M.A. and Birchler J.A. 2005. RNAi- mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6: 24-35.
10. Environmental Effects of Transgenic Plants. The Scope and Adequacy of Regulation. Washington DC: National Academy Press (2002), pp. 320
11. Wang MB, Abbott DC, Waterhouse PM (2000) A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus. Mol Plant Pathol 1:347-356
12. Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407:319-320
13. Collinge DB, Jorgensen HJ, Lund OS, Lyngkjaer MF Engineering pathogen resistance in crop plants: current trends and future prospects. Annu Rev Phytopathol 48:269-291
14. Huang G, Allen R, Davis EL, Baum TJ, Hussey RS (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc Natl Acad Sci U S A 103:14302-14306
15. Yin C, Jurgenson JE, Hulbert SH (2010) Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Mol Plant Microbe Interact 24:554-561
16. Pelaez P, Sanchez F (2013) Small RNAs in plant defense responses during viral and bacterial interactions: similarities and differences. Front Plant Sci 4:343
17. Galambos, A., A. Zok, A. Kuczmog, R. Oláh, P. Putnoky, W. Ream and E. Szegedi (2013). "Silencing Agrobacterium oncogenes in transgenic grapevine results in strain-specific crown gall resistance." Plant Cell Reports 32(11): 1751-1757.
18. DeFrancesco L, Watanabe M (2008) Vintage genetic engineering. Nature Biotech 26:261-263.
19. Gresshoff PM, Doy CH (1974) Derivation of a haploid cell line from Vitis vinifera and the importance of the stage of meiotic development of anthers for haploid culture of this and other genera. Z Pflanzenphysiol 73:123-141
20. Hirabayashi T, Kozaki I, Akihama T (1976) In vivo differentiation of shoots from anther callus in Vitis grape research. HortSci 11:511-512
21. Martinelli, L.; Gribaudo, I.; 2009: Strategies for effective somatic embryogenesis in grapevine: an appraisal. In: C. ROUBELAKIS-Angelakis (Ed.): Grapevine Molecular Physiology and Biotechnology, 461-486. Dordrechts: Kluwer Academic Publishers.
22. Torregrosa, L., A. Bouquet and P. G. Goussard (2001). In Vitro Culture and Propagation of Grapevine. Molecular Biology & Biotechnology of the Grapevine. K. Roubelakis-Angelakis, Springer Netherlands: 281-326.
23. Gambino G, Bondaz J, Gribaudo I (2006) Detection and elimination of viruses in callus, somatic embryos and regenerated plantlets of grapevine. Eur J Plant Pathol 114:397-404.
24. Torres-Viñals M, Sabaté-Casaseca S, Aktouche N, Grenan S, Lopez G, Porta-Falguera M, Torregrosa L (2004) Large-scale production of somatic embryos as a source of hypocotyl explants for Vitis vinifera micrografting. Vitis 43:163-168.
25. Dutt M, Li ZT, Kelley KT, Dhekney SA, Van Aman M, Tattersall J, Gray DJ (2007) Transgenic rootstock protein transmission in grapevines. Acta Hort 738:749-754