Морфология, систематика, экология молочнокислых бактерий вина - Экология и распространение бактерий молочнокислого брожения

Присутствие молочнокислых бактерий на винограде

Присутствие молочнокислых бактерий на винограде было обнаружено совсем недавно (Пейно и С. Домерк, 1961, 1962). Радлер (1958) выделил из виноградных листьев бактерии, способные сбраживать яблочную кислоту, а по данным Окса (1959), эти бактерии могут вызывать болезни растения, выражающиеся в увядании гребней и плода.
На винограднике молочнокислые бактерии распределены неравномерно. На практике каждый год наблюдают, что яблочно-молочное брожение труднее происходит в винах с определенными характеристиками или из одних определенных районов по сравнению с другими винами, без какой-либо возможности объяснить это явление составом винограда.
Классификация молочнокислых бактерий

В начале спиртового брожения присутствие бактерий остается незамеченным, так как размножение дрожжей протекает намного быстрее и в больших количествах; но при внимательном наблюдении с помощью микроскопа, начиная с четвертого или пятого дня брожения, в чане обнаруживают присутствие бактерий различного вида. Обычно это бактерии яблочно-молочного брожения. Что касается болезнетворных бактерий, то они, по всей видимости, присутствуют на винограде так же, как и другие микроорганизмы, но развиваются далеко не всегда, а лишь в тех случаях, когда этому способствуют условия и среда.
Пейно и Домерк провели систематические исследования по распределению молочнокислых бактерий. Необходимо подчеркнуть, что эти бактерии встречаются как в районах производства винограда, идущего на приготовление ликерных вин, в которых обычно не бывает яблочно-молочного брожения, так и в тех районах, в которых это превращение полезно. Однако можно считать, что бактерии яблочно-молочного брожения имеют меньшее распространение, чем дрожжи и уксуснокислые бактерии.
В серии сусел, обсемененных культурой Sacch. oviformis, присутствие бактерий наблюдалось только 5 раз вместо 8, что подтверждает факт угнетения яблочно-молочного брожения некоторыми дрожжами.
В 1961 г. параллельно с выделением бактерий из прессового сусла производили изоляцию их из воды, которой промывали грозди винограда на месте. До начала операции вода была стерильной. Промывной водой обсеменяли питательную среду, содержащую яблочную кислоту. При этом были отмечены случаи сбраживания Яблочной кислоты.
Наблюдалось присутствие молочнокислых бактерий в прессовых суслах (в %):
Прессовые сусла
при их рН, не обсемененные дрожжами 25
при рН 3,8, не обсемененные дрожжами 60
при их рН, обсемененные дрожжами 5
Вода, использованная для мытья винограда 31

При естественном рН виноградного сусла, например при рН от 3,1 до 3,5, установлено, что большая часть молочнокислых бактерий винограда не способна развиваться.

Присутствие молочнокислых бактерий в подвалах

Присутствие таких бактерий на винодельческом оборудовании и в производственных помещениях вполне возможно; общеизвестен риск загрязнения нового вина при помещении его в бочки или в буты, ранее содержавшие испорченные виноматериалы. Точно так же в отдельных случаях может проявиться яблочно-молочное брожение вследствие обсеменения винодельческих емкостей. Но меры по поддержанию оборудования бродильных цехов и подвалов в чистом и стерильном состоянии, необходимые для предотвращения порчи вин, одновременно препятствуют и обсеменению их бактериями яблочно-молочного брожения. Ж. Риберо-Гайон установил постоянное присутствие бактерий, воздействующих на яблочную и иногда на винную кислоту, на полах винодельческих заводов и винных подвалов. Вина, приведенные к рН 4,0, и растворы винной кислоты были распределены по флаконам и стерилизованы нагреванием. Затем эти жидкости загрязняли различными способами, закупоривали и оставляли на несколько недель при температуре 25° С. В этих условиях наблюдали сбраживание винной кислоты во всех флаконах, загрязненных частицами, взятых с влажных или сухих полов бродильных цехов, и, наоборот, не отмечалось никакого развития бактерий из плесени на стенах, из кусочков дерева, взятых с наружной поверхности бочек или в результате контакта в течение многих часов с воздухом бродильных помещений. Аналогичные опыты с использованием вина с высоким содержанием яблочной кислоты показали присутствие бактерий яблочно-молочного брожения на полу и на древесине бочек и отсутствие их в плесени на стенах и в воздухе подвалов.
Вебб и Ингрэм (1960) указывают, что возбудитель самопроизвольного брожения вносится не с виноградом, а поступает прежде всего из бродильных чанов.

Присутствие молочнокислых бактерий в винах

Присутствие бактерий в молодых винах представляет обычное явление. Если при соблюдении необходимых условий асептики взять в бутылку некоторое количество молодого вина сразу же на выходе из бродильного чана, закупорить и оставить ее на несколько недель при температуре 25° С, то всегда наблюдают развитие бактерий, если только виноград или сусло не подвергались сильной сульфитации.

Молочная кислота L (+) как контроль присутствия молочнокислых бактерий в виноделии

Образование молочной кислоты в процессе спиртового брожения сахара имеет место всегда, но оно относительно невелико. Для такой природной среды, как виноградное сусло, среднее количество образующейся кислоты составляет около 200 мг/л. Все дрожжи, способные к брожению, за исключением одних, которые были исследованы авторами, т. е. 30 видов, дают D(—)- молочную кислоту и лишь следы L( + )- молочной кислоты. Штаммы одного и того же вида различаются по общему производству молочной кислоты, но не по природе этой кислоты. При рН меньше 4,0 содержание образовавшейся L ( + )-молочной кислоты никогда не превосходило 15 мг/л. Sacch. veronae является единственным видом, способным образовать повышенные количества L( + )-молочной кислоты, вплоть до 1,8 г/л, но эти дрожжи в виноделии встречаются редко.
Таким образом, вина, не подвергшиеся действию бактерий, содержат мало молочной кислоты, обычно менее 0,5 г/л, включающей большую часть изомера D(—). В винах, где происходило яблочно-молочное брожение, молочная кислота находится в более значительных количествах и состоит в основном из изомера L( + ), поскольку при яблочно-молочном брожении образуется только эта кислота.
Другими словами, когда вино проходит чистое спиртовое брожение, в смысле «брожения, свободного от молочно-кислых бактерий», оно содержит почти исключительно D(—)-молочную кислоту; когда же оно подверглось, кроме того, яблочно-молочному брожению, оно содержит главным образом L( + )-молочную кислоту; наконец, когда действие бактерий направлено на восстанавливающие сахара (молочнокислое скисание), конфигурация молочной кислоты зависит от вида бактерий.
В качестве примера в табл. 10.2 показана эволюция L( + )-молочной кислоты, определенной ферментативным путем во время спиртового, брожения винограда красных сортов в нескольких чанах.
В чане А сусло сульфитировали из расчета 50 мг/л сернистого ангидрида путем перемежающегося орошения дробленой массы сернистым раствором, в чане Б — с помощью устройства с регулируемым стоком, в чане В — посредством автоматического дозировочного насоса для сульфитации; он был спущен по истечении 4 дней.

Образование молочной кислоты L (+) (в г/л) в процессе виноделия по красному

В отдельных чанах со слабой сульфитацией или совсем без нее образование небольшого количества L( + )- молочной кислоты начинается уже в день наполнения. Затем содержание ее постепенно возрастает, особенно в мезге на протяжении всего периода спиртового брожения и после его завершения. Оно бывает более интенсивным при длительном брожении на мезге, чем при коротком, и может достигать 150 мг/л ко времени спуска чана. Эти значения намного превосходят те, которые могут быть получены только дрожжами, и в самых благоприятных условиях составляют от 15 до 20 мг/л. Таким образом, можно сделать вывод, что молочнокислые бактерии присутствуют в дробленой массе и проявляют свою активность с момента наполнения бродильных емкостей. Внимательное наблюдение в микроскоп подтверждает их присутствие, следовательно, энзиматический анализ L( + )-молочной кислоты представляет собой чувствительный и точный способ раннего обнаружения бактерий при производстве вин; он более чувствителен, чем прямое наблюдение под микроскопом, точнее, чем количественный анализ летучей кислотности или яблочной кислоты.
Таким путем авторам удалось наблюдать во время последних сезонов виноделия, что бактерии появляются в бродильных емкостях очень рано, значительно раньше, чем можно было думать; однако их развитие прерывается сульфитацией.
На винограде существуют молочнокислые бактерии; они, несомненно, находятся также на оборудовании и в производственных помещениях, следовательно, виноград в большей степени обсеменен самой разнообразной молочнокислой микрофлорой. Среди этих бактерий далеко не все способны развиваться в вине: некоторые не могут размножаться при рН сусла или вина, но они могут в дальнейшем развиваться в выжимке, в зонах с более высоким рН, которые создает мацерация кожицы и семян, тканей винограда, менее кислых и богатых минеральными веществами; другие бактерии быстро подавляются спиртом, образованным дрожжами. Наконец, остается лишь очень небольшой процент бактерий винограда, которые выживают и вызывают в последующем яблочно-молочное брожение, постепенно приспосабливаясь к условиям среды, в данном случае вина.
Весьма похоже на то, что некоторые молочнокислые бактерии начинают развиваться в сусле с момента дробления винограда и заполнения чанов соком, но они быстро ингибируются спиртом и в дальнейшем размножаются очень медленно. Некоторые бактериальные клетки приспосабливаются к среде через более или менее длительный латентный период. Нужно также учитывать тот факт, что в процессе брожения среда становится все менее и менее благоприятной для молочнокислых бактерий возможно вследствие истощения дрожжами питательных веществ. Последние конкурируют с бактериями и в целом находятся в более выгодном положении, поскольку они намного превосходят бактерии по численности, лучше приспособлены к условиям рН, а селективный эффект сульфитации идет им на пользу.
Все эти наблюдения показывают, что яблочно-молочное брожение, которое возникает через несколько дней или недель после окончания спиртового брожения, происходит после длительного периода адаптации бактерий, начавшейся сразу же после дробления винограда. Естественное яблочно-молочное брожение является результатом деятельности устойчивых бактериальных клеток и их медленной приспособляемости к среде.

Распространение различных видов молочнокислых бактерий

Как правило, кокки встречаются в винах в процессе яблочно-молочного брожения чаще, чем бациллы. Соотношение обеих форм бактерий может зависеть от климата или от исходной кислотности сусла.
Не претендуя на то, чтобы служить общим законом, процентные отношения, приведенные в табл. 10.3 и рассчитанные на пробах Домерк, все же, по- видимому, хорошо отражают его сущность. Таким же образом Малан и сотрудники (1965) обнаружили на севере Италии только кокки, тогда как, наоборот, Пуатвэн и сотрудники (1963) в Уругвае, Ди Пляси и Ван Цил (1963) в Южной Африке, т. е. в значительно более теплом климате, не обнаружили гетероферментативных кокков.
В табл. 10.4 дано распределение штаммов, взятых из различных видов среды. На винограде было найдено больше бацилл, чем кокков, принадлежащих к небольшому числу видов. В суслах, находящихся в стадии спиртового брожения, находили больше кокков, чем бацилл. Наконец, в вине, подвергшемся бактериальной порче, бациллы находятся в преобладающей пропорции.

Число кокков и бацилл в винах в процессе яблочно-молочного брожения, %

Amerine M. A. et K'unkee R. E. (1968), Microbiology of winemaking. Ann. Rev. Microb., 22, 323.
Bar re P. (1966), Ann. Technol. agric., 15, 173.

Tаблица 10.4

Частота и распределение видов молочнокислых бактерий (по данным Пейно и С. Домерк. Результаты статистической обработки опытов на 670 штаммах)

В испорченных винах находятся все группы бактерий, так же как и в винах, в которых протекает яблочно-молочное брожение. Однако бациллы чаще всего выделяют из больных вин, а кокки главным образом из вин в процессе биологического раскисления.
В испорченном вине обычно находили бактерии, принадлежащие только к одной группе. С другой стороны, бывает, что яблочно-молочное брожение молодого вина происходит под воздействием смеси нескольких видов бактерий. Так, авторам приходилось выделять из одного и того же вина иногда кокки и бациллы или смесь из Leuconostoc gracile и Leuconostoc oinos; штаммы, действующие или нет на лимонную кислоту; другие штаммы, воздействующие или нет на винную кислоту; наконец, штаммы, имеющие различные пороги рН. Самопроизвольное яблочно-молочное брожение необязательно вызывается одним видом бактерий.