Селекция винограда на бессемянность, крупноягодность и раннеспелость на полиплоидном уровне

Волынкин В.А.,  доктор с.-х. наук, НИВиВ «Магарач»
Зленко В.А., научный сотрудник, к.с.-х.н. НИВиВ «Магарач»
Лиховской В.В.,   заведующий сектором питомниководства НИВиВ «Магарач»
       

Эффективность отрасли виноградарства во многом зависит от возделываемого сортимента.  Культивирование конкретного сорта в определенных почвенно-климатических условиях в значительной мере влияет на эффективность использования земли, орошения, применения удобрений, химикатов и других необходимых при возделывании агротехнических мероприятий.
Во всем мире наблюдается возрастающее внимание к бессемянному столовому винограду как полезному по диетической и питательной ценности продукту питания, который пользуется высоким спросом в течение круглого года. Эта тенденция неоднократно отмечалась на Генеральных ассамблеях Международной организации винограда и вина.
Наиболее перспективным направлением в селекции винограда на создание бессемянных сортов является сочетание в одном генотипе бессемянности с  устойчивостью к неблагоприятным воздействиям внешней среды, болезням и вредителям. Но сегодня потребителя интересуют также размер ягод, величина грозди, окраска и вкусовые качества столового винограда, что в целом определяет товарность продукции сорта. Проведенными ранее исследованиями установлено, что рост и линейные размеры ягод коррелируют с массой семян в ягодах, поскольку в семенах синтезируются гиббереллины, и чем больше масса семян в ягодах, тем они больше их продуцируют и, следовательно, вырастают более крупные ягоды [9]. В связи с существованием такой закономерности пока не получены бессемянные сорта винограда с ягодами крупнее 6 г.
С другой стороны в биологии известна возможность существования фертильных растений с увеличенным набором хромосом (полиплоидов). Около 45 % растительных видов на Земле представлено полиплоидами. Наиболее ценные культурные растения, такие как пшеница, овес, арахис, картофель, брюква, горчица, слива, земляника, ежевика, табак, люцерна, тимофеевка, топинамбур, багат, оливковое дерево, сахарный тростник и другие, являются полиплоидами [10].  
Каждый вид растительного и животного организма характеризуется определенным и константным числом хромосом, которое в соматических клетках бывает в два раза больше (2n – диплоидное), чем в зрелых половых клетках (n – гаплоидное). Изменчивость числа хромосом в пределах вида встречается крайне редко [1].
B. R. Nebel (1929) установил диплоидный набор хромосом (2n = 38) у видов V. vinifera, V. labruska, V. amurensis, V. coignite и V. doniana [12].   
Однако в результате нарушения клеточного деления число хромосом может изменяться.
Полиплоидия связанна с кратным увеличением хромосом в ядрах клеток организма. Полиплоидный ряд может быть представлен как сбалансированными, так и несбалансированными типами хромосомных чисел. К первым относятся 2n - диплоидный, 4n – тетраплоидный, 6n – гексаплоидный, 8n – октаплоидный, 10n – декаплоидный; ко вторым – 3n – триплоидный, 5n - пентаплоидный, 7n – гектаплоидный, 9n – эннаплоидный наборы хромосом. Растительные организмы с большей плоидностью встречаются реже.
У полиплоидных организмов часто увеличиваются размеры репродуктивных органов (цветков, плодов и семян), изменяются физиологические процессы, повышаются пластичность и устойчивость к условиям окружающей среды, что в конечном итоге ведет к значительному увеличению их адаптивного потенциала. У тетраплоидов винограда, как правило, грозди и ягоды крупнее (они часто и более раннеспелые), а листья, побеги и общий габитус растения мощнее, чем у диплоидов, что указывает на их большую жизнеспособность [11].
Первые тетраплоидные формы винограда установлены B. R. Nebel, который при цитологическом исследовании сортов обнаружил, что крупноягодные клоны Muskat gigas и Sultanina gigas содержат в соматическом наборе удвоенное число хромосом (2n = 76), а у обычных растений этих же сортов 2n = 38 [12].
О соматической мутации у сорта Султанина (Кишмиш белый овальный, Thompson Seedless) сообщил H. P. Olmo [13]. Автор отмечает, что крупноягодные спорты этого сорта были несколько раз обнаружены на виноградниках Калифорнии. Все они отличались от исходного сорта увеличенным размером гроздей, ягод, листьев толстыми побегами и укороченными междоузлиями. У некоторых вес одной грозди достигал 2 кг, а средний вес ягод – 3,6 г. Самые крупные ягоды весили 5 г, что почти в два раза больше, чем у исходного сорта.
В работах H. P. Olmo сообщается о новых тетраплоидных формах винограда, обнаруженных среди крупноягодных японских сортов[14, 15]. 
Огромный вклад в цитогенетику винограда внес Ш. Г. Топалэ. Им с коллективом сотрудников проанализировано на число хромосом более 1000 сортов и клонов винограда из ампелографических коллекций МолдНИИВиВ НПО «Виерул» и НИВиВ «Магарач». Оказалось, что подавляющее большинство сортов винограда имеют в соматическом наборе 38 хромосом и, следовательно являются диплоидами. Только сорта Шасла Гро Куляр розовая, Шасла Гро куляр белая и Сажарет – истинные тетраплоиды с тетраплоидным перициклом и соматическим числом хромосом 2n = 76. Шасла диамант, Шасла Бернардская и четыре  клона – Рислинг крупноягодный, Шабаш крупноягодный, Мускат александрийский крупноягодный, Кишмиш белый крупноягодный – миксоплоиды. У миксоплоидов при макроспорогенезе в семяпочке образуются два рода макроспор, из которых в женском гаметофите (зародышевом мешке) формируются два рода гамет – гаплоидные и диплоидные яйцеклетки в соотношении примерно 3 : 1. В пыльниках соцветий при микроспорогенезе также образуются микроспоры двух родов, из которых в мужском гаметофите формируются гаплоидные (n = 19) и диплоидные (n = 38). Однако в отличие от  женских диплоидные и гаплоидные мужские гаметы встречаются с равной частотой [11].
В НИВиВ «Магарач» проводилась большая работа по гибридизации тетраплоидных форм и диплоидных сортов винограда. Для создания новых генотипов включались в гибридизацию путем скрещивания диплоиды с полиплоидами; полиплоиды с полиплоидами.  В результатом длительной работы получен триплоидный сорт Поливитис Магарача (3n = 57), родительскими формами которого являются  Ката Курган и тетраплоидный сорт Шасла Гро Куляр белая.
Наряду с положительными особенностями (например, увеличение размера гроздей и ягод) у полиплоидов имеется ряд нежелательных свойств. Главными из них является пониженная плодовитость, недостаточно высокая продуктивность, а так же низкие вкусовые качества. Известно, что плодовитость регулируется системой полигенов или генов-модификаторов, находящихся у диплоидов в сбалансированном состоянии. Увеличение количества хромосом, видимо, вызывает нарушение этого стройного равновесия, и как следствие приводит к бесплодию. Семенное бесплодие вызывается также нарушениями физиологического баланса, ненормальностями при образовании пыльцы, аномалиями опыления, нарушениями роста пыльцевых трубок и оплодотворения. Отклонения от норм при мегаспорогенезе у полиплоидов приводит к двум типам нарушений – до оплодотворения, приводящее к «гаплоидной стерильности» и после оплодотворения, вызывающее аномальное развитие эндосперма и зародыша – «зиготическая стерильность» [5].
У триплоидов сильно выражена стерильность. В их потомстве появляются в различных соотношениях диплоидные и анеуплоидные формы. Объясняется это очень сильным нарушением мейоза вследствие образования тривалентов, а также наличием унивалентых хромосом [3]. У бессемянного винограда, также нарушен процесс оплодотворения.
В последнее время экспериментальным получением полиплоидов занимаются во многих цитогенетических и селекционных лабораториях. Методика этих работ очень разнообразна: изменение температурных условий, использование  ионизирующего излучения и всевозможных химических (действие различных мутагенов) и механических воздействий (удаление верхушки побегов, пасынкование и др). Наиболее успешные результаты получены при использовании некоторых химических веществ, например колхицина, аценофтена и др. Как  бы сильно не отличались между собой все перечисленные реагенты, применение их сводится к воздействию на механизм митоза и мейоза для получения полиплоидных клеток.
Полиплоиды можно получать, применяя химические вещества, которые, оказывая наркотическое действие на митотический аппарат (блокада веретена), задерживают расхождение сестринских хроматид к противоположным полюсам клетки в процессе митоза, вследствие чего число хромосом удваивается. В дальнейшем из этой тетраплоидной клетки, которая приобретает способность к нормальному делению, образуется ткань, затем побег и репродуктивные органы.
Однако, после обработки мутагенами и полиплоидогенами вегетативных органов растений, в частности колхицином, образуются в большей степени мозаичные, в том числе и миксоплоидные растения, реже получаются периклинальные и секториальные химеры. В процессе онтогенеза миксоплоидных  растений химерность изменяется и чаще появляются периклинальные химеры. В дальнейшем часто побеги «расхимериваются», но их нижняя часть состоит из плоидных тканей [6].
Имеются сведения о получении с помощью колхицина полиплоидных форм винограда [2].
Существуют различные методы получения полиплоидных форм. Среди них обработка семян, обработка сеянцев в семядольном состоянии, обработка побегов окорененных черенков (метод Дермена). Концентрация раствора колхицина 0,12; 0,25, и  0,5% [7].
Каждая клетка организма реагирует на колхицин как самостоятельная единица. При применении различных способов обработки колхицином большого количества сортов установлено, что в зависимости от генотипа и состояния объекта по разному происходит как проявление мутаций, так и сохранение мутагенного эффекта [5].
Известно, что полиплоидия не является вполне устойчивой  и в ряде случаев индуцированные полиплоиды возвращаются в диплоидное состояние. Плоидность тканей часто меняется в онтогенезе, что отмечается при повторных цитологических исследованиях обработанных растений и при получении изменений морфологических признаков. Тетраплоидные клетки делятся медленнее диплоидных, поэтому наблюдается постепенное вытеснение первых. Большинство измененных побегов, достигнув 20 см, расхимериваются, но нижняя часть побегов всегда имеет мутантные ткани.
С помощью обработки колхицином вегетативных частей растений и семян получить тетраплоидное растение винограда, состоящее на 100 % из тетраплоидных клеток, невозможно. Большинство исследователей создавших с его помощью искусственные полиплоиды самых разнообразных культур отмечают, что при этом, как правило, образуются химеры, состоящие из диплоидных и тетраплоидных клеток и тканей, а не 100 % - ные полиплоиды. Установлено, что если перицикл состоит из полиплоидных клеток, то генеративные органы растения или отдельного побега – цветки и семена – также являются полиплоидными. Растения с полиплоидным перициклом при макро- и микроспорогенезе в семяпочках и пыльниках образуют два вида макро- и микроспор, а соответственно и половых клеток – диплоидные ( n = 38) и гаплоидные (n = 19) гаметы, которые в результате оплодотворения приводят к формированию разногаметного потомства, состоящего из ди- три- и тетраплоидных сеянцев. Согласно исследованиям Ш. Г, Топалэ, 100 % - ный  тетраплоид винограда можно вырастить только из семян. Нельзя сравнивать «сырые» митотические полиплоиды с мейотическими, полученными с помощью гибридизации [5].
Цель настоящих исследований заключалась в получении крупноягодных полиплоидных бессемянных форм винограда путем гибридизации  обработанных колхицином  материнских и отцовских форм, изучение влияния обработки колхицином  почек виноградного растения и формирование миксо-и полиплоидных форм, определение фазы развития для обработки, подбор концентраций раствора, установление  продолжительности обработки для получения полиплоидных побегов, соцветий, диплоидных и гаплоидных гамет.
В  опыте использовали в качестве исходных шесть материнских гибридных форм (далее г.ф.), имеющих функционально женский тип цветка, три из которых имеют в генотипе бессемянные сорта.
Гибридная форма Лора имеет очень большие по величине  грозди, очень крупные овальные, желтой окраски ягоды. Консистенция ягод отличается весьма мясистой мякотью, кожица при еде не ощущается.
У г.ф. Талисман ягоды достигают массы до 24 грамм. Эта форма обладает высокой морозостойкостью - 25 ºС, а также хорошей всхожестью семян, до 40 %, высокой жизнеспособностью сеянцев и передачей своему гибридному потомству признака крупноплодности ягод.
    На примере г.ф. Подарок Запорожью полученной в результате гибридизации Талисман на Восторг, мы наблюдаем передачу признака крупноплодности ягод, от исходной материнской формы Талисман. Данная г.ф. обладает повышенной устойчивостью к грибным заболеваниям милдью и оидиуму.
    Г.ф. Гурман ранний получена в результате скрещивания Талисмана с бессемянным сортом Кишмиш лучистый. В представленной форме прослеживается наследование признака   крупноплодности ягод от исходной материнской формы Талисман, что подтверждает вероятность использования г.ф. Талисман в качестве донора источника крупноплодности.
    Сорта Аркадия на Кишмиш лучистый являются исходными родительскими формами г.ф. Прометей. В этом потомстве мы наблюдаем передачу бессемянным сортом Кишмиш лучистый розовой окраски ягод. Данная форма обладает ярко выраженным мускатным вкусом.
    Г. ф. София из той же семьи Аркадия на Кишмиш лучистый. Имеет также розовую окраску ягод, но не столь интенсивную как у Прометея. Эта форма имеет очень большие нарядные грозди, очень крупные ягоды с мускатным ароматом.
Из данных приведенных в таблице 1 видно, что основной принцип подбора исходных форм заключается в  передаче  гибридному потомству крупноплодности ягод, величины грозди, нарядной окраски а также  различных сроков созревания.
Таблица 1. Краткая характеристика материнских исходных форм

 На основе проведенных ранее скрещиваний представленных г.ф. в потомстве с vitis vinifera получены семенные формы неустойчивые к условиям внешней среды, болезням и вредителям. Поэтому переходим к подбору исходных отцовских бессемянных сортов устойчивых к абиотическим и биотическим факторам.

Таблица 2. Краткая характеристика отцовских фор для скрещивания на бессемянность

*- в скобках приведены номера кодов МОВВ

Из таблицы 2, мы видим, что размер грозди у всех форм варьирует от 5 до 9, по степени выраженности 9 баллов – это очень большая гроздь (Кишмиш лучистый, Ялтинский). Степень устойчивости листьев к милдью практически у всех межвидовых бессемянных форм составляет 7 баллов, где  9 баллов является максимальной устойчивостью сортов.
Таким образом, в опыте участвуют исходные формы с наиболее крупными ягодами и обладающие устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам и проявившие себя в качестве доноров высокой степени выраженности данных признаков при передаче их потомству. Применение же колхицина должно обеспечить получение у исходных форм гамет с двойным набором хромосом, что в свою очередь при гибридизации позволит получить или тетраплоидные или триплоидные гибриды, которые будут иметь увеличенные размеры как ягод, так и гроздей. Применение колхицина при обработке почек исходных материнских и отцовских форм с диплоидным набором хромосом основано на возникновении их искусственных полиплоидов на диплоидных кустах.
Для определения соответствующих сроков и концентраций применения колхицина были проведены  в 2006-2008 годах обработки почек в два срока: 1) во время их распускания; 2) во время закладки в них генеративных органов. Для обработки применялись концентрации колхицина в растворе Н2О: 0,12; 0,25, и 0,5 %. Раствор колхицина  наносился на ватный тампон, который накладывался непосредственно на почку и обвязывался эластичным влагонепроницаемым материалом, пропускающим воздух. Продолжительность обработки составляла 7 дней и проходила в два срока: от начала набухания до распускания почек и  от  начала до конца цветения. Выявление миксоплоидных побегов с изменениями под воздействием колхицина проводилось по диагностирующим морфологическим признакам.
В опыте по обработке колхицином почек во время их распускания (опыт 1) в вариантах обработки 1 и 2 морфологические признаки побегов, развившихся из обработанных почек, не отличались от контрольного варианта (без обработки).  Изменения побегов и листьев наблюдались только в варианте обработки 0,5% раствором колхицина. Побеги имели утолщенную форму с короткими междоузлиями. Листья очень сильно отличались от контроля и имели гофрированную форму, с интенсивной темно-зеленой окраской.  На два узла выше соцветия наблюдалось разветвление побегов. После разветвления развивались побеги  с обычной толщиной и длиной междоузлий свойственной исходной форме. Таким образом, полученные побеги до ветвления, в результате обработки раствором колхицина в концентрации 0,5 %, соответствовали по вышеизложенным морфологическим признакам полиплоидным формам. Раздвоенные побеги по морфологическим признакам, по всей вероятности, являлись диплоидными. На полученных полиплоидных побегах сформировались соцветия, которые были использованы во время цветения для гибридизации.
Образовавшиеся ягоды у г.ф. Талисман после обработки колхицином почек во время закладки в них генеративных органов (опыт 2) имели вытянутую ассиметричную форму в отличие от слегка овальной формы ягод  присущей, этой г.ф. Были получены семена, размеры которых существенно варьировали. Семена отличались формой, и если у контрольных семян мы наблюдается вытянутая форма, то  в опыте после обработки колхицином  отмечаются более округлые, выпуклые семена.  Полученные семена были высеяны в гидропонику, часть на питательную среду в культуру in vitro, некоторые из них проросли и выросли сеянцы.
В 2008 г.  с целью подтверждения правильности выбранного метода колхицинирования был проведен цитологический анализ. Побеги из обработанных колхицином  почек при достижении 2 - 4 см были срезаны и помещены в фиксирующий раствор состоящий из уксусного алкоголя, на 12 часов. Зафиксированные побеги были извлечены из уксусного алкоголя и законсервированы  в 70 % спирте.
Цитологический анализ зафиксированных побегов был проведен  кафедрой физиологии растений  Таврического Национального Университета г. Симферополь с участием специалистов (Бугара А. М., Теплицкая Л. М., Бугара И. А.). Приготовление красителя, окрашивaниe и приготовление препаратов проводили согласно методике (Паушева З. П., 1988). На фотографии метафазной пластинки хромосом полученной с препарата г.ф. Талисман  видно, что количество хромосом больше 50, точнее подсчитать не получилось. На фотографиях видны oтдeльные хромосомы, но из-за глубины препарата хромосомы лежат в нескольких плоскостях. Тем не менее, проведенный цитологический анализ и полученные фотографии подтверждают, что в результате обработки колхицином удалось получить миксоплоидные формы винограда, которые были использованы в гибридизации.
Можно предположить, что в потомстве будут получены также полиплоидные формы, обладающие более крупными ягодами и гроздями, чем исходные диплоидные семенные и бессемянные сорта. Для окончательного вывода о том, что действительно получены гибриды с увеличенным набором хромосом, что это будет сохраняться при вегетативном размножении, необходимо провести повторный цитогенетический анализ.