Индукция сомаклонов вишни in vitro

УДК 634.22: 581.143.6
И.Г. Тихонова
ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И. В. Мичурина, г. Мичуринск
Приведены биотехнологические методы получения оздоровленных и устойчивых к вирусным заболеваниям сомаклонов вишни из инфицированных листовых эксплантов.
Индукция сомаклональной изменчивости путем введения в культуру in vitro является одним из перспективных направлений селекционного улучшения существующих сортов [1].

В связи с повсеместным распространением вирусных заболеваний вишни некротической (NRSV), хлоротической (PDV) [2, 3], зеленой (GRMV) [4] кольцевых пятнистостей, а также ямчатости древесины косточковых (P. stem pitting) и их комплексов снижается урожайность, качество плодов и долговечность пораженных деревьев, а также их репродукционные способности (всхожесть семян и приживаемость глазков в питомнике). Из-за сильного поражения вирусными заболеваниями многие ценные сорта косточковых культур снимаются с производства. В связи с этим, ряд европейских стран перешли на безвирусное питомниководство, которое предусматривает постоянный фитосанитарный контроль с применением иммунодиагностики вирусов. Однако одним из наиболее эффективных способов защиты растений от вирусных заболеваний является получение устойчивых сортов, что является важнейшим условием перехода к адаптивной системе растениеводства, т.е. экологической безопасности и рентабельности.
В результате многолетней оценки генофонда вишни на устойчивость к распространенным вирусным заболеваниям и гибридизации контрастных по поражаемости вирусами сортов вишни нами получены относительно устойчивые и устойчивые элитные формы вишни [5], резистентность которых можно усилить путем беккроссов, однако это довольно длительный путь, к тому же, низкая всхожесть семян является серьезным препятствием к увеличению генетического разнообразия этой культуры.
В настоящее время интенсивно разрабатываются методы получения оздоровленных и создания устойчивых форм растений с помощью технологий культивирования in vitro клеток и тканей.
Одной из задач биотехнологии растений является разработка нетрадиционных методов селекционного улучшения растений по устойчивости к вирусным заболеваниям и получение оздоровленных форм методами сомаклональных вариантов. В качестве возможных источников сомаклонов называют генетическую гетерогенность клеток в тканях растений, спонтанный и транспозонный мутагенез, рекомбинационные процессы в клетках [6]. У сомаклональных вариантов выявлены изменения плоидности, хромосомные перестройки, точечные ядерные и цитоплазматические мутации.

Сомаклональная вариабельность представляет высокий уровень спонтанной изменчивости в культурах соматических клеток, а также в популяциях, полученных из них растений-регенерантов. Сомаклональная изменчивость среди растений-регенерантов представляет широко распространенное и генетически доказанное явление. Она является результатом генетической гетерогенности тканей исходного экспланта. Тканевая селекция основывается, в основном, на сомаклональной изменчивости, которая представляет интерес как простой способ получения генетического разнообразия путем регенерации клонов растений из клеточных культур.
В популяциях сомаклонов обнаружены варианты, превосходящие исходные сорта по различным хозяйственно ценным признакам, в т.ч. по устойчивости к вирусным болезням [7]. Клеточная селекция на устойчивость к вирусам является более сложной по сравнению с грибами и бактериями из-за отсутствия селективных систем. Известно, что каллусные ткани, индуцированные из системно зараженных растений, представляют собой мозаику из здоровых и зараженных вирусами клеток [8].
Установлено, что потомство сомаклонов, регенерированных из инфицированной каллусной ткани, обладает более высокой устойчивостью к вирусам, чем соответствующие сомаклоны из здоровых каллусов. Благодаря тотипотентности растительной клетки из гетерогенной популяции клеток с разной восприимчивостью к вирусам можно получить оздоровленные и устойчивые к вирусам формы [9].
Выявлено преимущественное размножение безвирусных и устойчивых к вирусам клеток в каллусных культурах табака, инфицированных суровым штаммом ВТМ [10]. Установлено, что высокая устойчивость передается потомству сомаклонов.
Из темно-зеленых островков, пораженных вирусом мозаики свеклы листьев, были регенерированы безвирусные растения [11].
Индуцированная в инфицированных ВТМ листьях табака устойчивость передается прямым регенерантам с высокой эффективностью и проявляется в первом поколении их потомства. Считают, что передача индуцированной устойчивости прямым регенерантам может использоваться для защиты вегетативно размножаемых растений от вирусов [12].
Для индукции каллусогенеза инфицированные вирусами НКП и ЗКП листовые экспланты вишни в асептических условиях вводили в культуру in vitro на модифицированную среду МС, содержащую 2,4-Д 1,0; ИУК, НУК и кинетин по 0,5 (в мг/л). Пробирки с эксплантами содержали в термостате при температуре 20-24 °С.
Отбор ткани для регенерации проводили по интенсивности роста каллуса, т.к. существует обратная зависимость между ростом каллуса и репродукцией в ней вируса [9].
Зональность распределения вирусов в пробирочной культуре ткани, установленную Л.Г. Брегетовой и др. [8], использовали для получения оздоровленного каллусного материала, т.к. вирусы присутствовали в верхней зоне каллусного столбика, состоящей из старых клеток, а в нижней, образованной молодыми клетками, его не было. Каллусная ткань освобождается от вирусов в процессе субкультивирования.
Для индукции морфогенеза отобранные инфицированные каллусы вишни расчленяли и пересевали на среду регенерации. Соотношение регуляторов роста в среде регенерации подбирали для определенных групп генотипов. Лучшие результаты по инициации почек и адвентивных побегов из инфицированной каллусной ткани получены на модифицированной среде МС, содержащей БАП 5,0-9,0; ИУК 1,0; 2,4-Д 1,0; ГК 1,0 (в мг/л).
Субкультивирование морфогенных каллусов проводили в люминостате в условиях 16-часового фотопериода с интенсивностью освещения 1500-3000 люкс и температуре 20-24 °С.
На образование органогенных структур положительное влияние оказывает внесение в среду регенерации метилурацила (10-30 мг/л), при этом наблюдается позеленение ткани, а затем образование почек, которые пересаживали на среду морфогенеза без 2,4-Д. Сформировавшиеся почки переносили на среду побегообразования (БАП, ИУК и ГК по 0,5 мг/л).
Так как на среде побегообразования многие почки приостанавливают свое развитие, их снова пересаживали на среду морфогенеза. В результате нескольких пассажей выход почек, индуцирующих побеги, значительно увеличивался.
Определенное число ночек и побегов у труднорегенерируемых генотипов можно получить при прямой регенерации методом in situ, т.е. непосредственно из темно-зеленых островков инфицированной вирусами ткани листа на среде, содержащей БАП 3,0-5,0; ИУК 0,7-1,5; ИМК 0,5; ГК 1,0 (в мг/л) с добавлением метилурацила (10-30 мг/л) и выдерживании эксплантов при низких положительных температурах в течение двух недель.
Субкультивирование образовавшихся при прямой регенерации почек на среде морфогенеза с метилурацилом и 2,4-Д при низких положительных температурах в течение нескольких пассажей привело к массовой закладке меристематических конусов нарастания, а затем почек. Таким путем можно инициировать регенерацию у труднорегенерируемых сортов для получения прямых растений-регенерантов с более высоким потенциалом устойчивости.
Адвентивные побеги, полученные из образовавшихся почек, переносили на среду размножения (БАП 1-2 мг/л, ИУК и ГК по 1 мг/л) в пробирки или колбы (250 мл). Выращивание побегов в колбах с добавлением 14-28 мг/л салициловой кислоты приводило к увеличению длины побегов и образованию корней даже без применения ИМК.
Сомаклоны, образовавшие разветвленную корневую систему, адаптировали к нестерильным условиям среды и высаживали в открытый грунт на доращивание. Из 12 регенерированных сортообразцов вишни сомаклоны грех форм проходят доращивание в открытом грунте, после чего будут тестированы на наличие вирусов. С помощью метода искусственного заражения будет определена степень устойчивости сомаклонов к определенным вирусам.

Литература

1. Барсукова Е.Н., Моисеенко Л.М Получение сомаклонов гречихи с селекционными характеристиками // Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях. - М: Изд-во МСХАэ 2001. - С. 139-140.
2. Семина Н.П., Цуканова Е.М. Использование иммуноферментного анализа для диагностики вирусных болезней плодовых культур // Методы эффективного ведения садоводства. - Мичуринск, 1996. - С. 102-110.
3. Тихонова И.Г. Оздоровление генофонда вишни от наиболее вредоносных вирусных заболеваний и оценка устойчивости их к ЗКП // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем. - Мичуринск, 1998. - С. 84-87.
4. Тихонова И.Г. Вирус зеленой кольцевой пятнистости - биотический стрессор вишни // Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства. - Пенза, 2002. - Т. П. - С. 201-203.
5. Тихонова И.Г. Использование генофонда вишни в селекции на устойчивость к вирусным заболеваниям // Проблемы сельскохозяйственного производства в изменяющихся условиях в XXI веке: Сб. материалов. - Пенза, 2000. - С. 159-161.
6. Шамина З.Б. Особенности генетической устойчивости соматических клеток растений // Биотехнология . - 1987. - Т. 3, № 3. - С. 351-364.
7. Щербатенко И.С. Биотехнологические методы конструирования и отбора вирусоустойчивых форм растений // Микробиологический журнал. - 1993. - Т. 55, № 1.-С. 89-101.
8. Брегетова Л.Г., Крылов А.В., Астахова А.А. Оздоровление растений от вирусов каллусным методом // Вирусные болезни сельскохозяйственных растений Дальнего Востока. - Владивосток, 1971. - С. 28-49.
9. Жук И.П. Теоретические и практические аспекты изучения фитопатогенных вирусов в культуре растительных тканей: Автореф. дис. докт. биол. наук. - Л., 1981.-45 с.
10. Получение соматических клонов табака, устойчивых к вирусубронзовости томатов / И.С. Щербатенко, А.Г. Коваленко, Л.Т. Олещенко и др. // Биол. науки. - 1989. - № 6. - С. 24-27.
11. Жук И.П., Бобырь А.Д., Сахно Т.Н. Вирусоустойчивость растений-регенерантов, полученных из темно-зеленых участков листьев сахарной свеклы, пораженной вирусом мозаики свеклы // С.-х. биология. - 1989. - № 3. - С. 68-70.
12. Устойчивость сомаклонов табака к вирусу бронзовости томатов / И.С. Щербатенко, А.Г. Коваленко, Л.Т. Олещенко и др. // Микробиологический журнал. - 1991. - Т. 53, № 3. - С. 75-80.