Биотехнология криосохранения семян и протокормов орхидей

УДК 581.143.6 + 581.165.1
БИОТЕХНОЛОГИЯ КРИОСОХРАНЕНИЯ СЕМЯН И ПРОТОКОРМОВ ОРХИДЕЙ
Г.Л. Коломейцева Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина, г. Москва Т. В. Никишина, Е.В. Попова, А.С. Попов Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва
Массовое размножение декоративных сортов и клонов, а также сохранение редких и исчезающих видов орхидных ex situ требует использования биотехнологических методов, среди которых наиболее значимыми являются семенное и микроклональное размножение in vitro и создание криобанков длительного хранения семян, меристем и протокормов.
Орхидеи - красивые и полезные травянистые растения, которые издавна используются как в декоративном садоводстве, так и в фармакологии, а в последние годы также и в производстве дамских шляпок и туалетов. Вместе с тем, семейство орхидных может служить примером крупного таксона цветковых растений, многие представители которого являются редкими и входят в Красные книги и международные списки охраняемых видов. Поэтому в настоящее время успешно разрабатываются биотехнологические методы их семенного и микроклонального размножения, которые, с одной стороны, способствуют сохранению природных популяций редких видов, а, с другой стороны, позволяют шире внедрить орхидные в коммерческое производство и садоводство в качестве лекарственных и декоративных растений. Тем самым они уже становятся отраслью сельского хозяйства.
Способами сохранения генофонда редких и эндемичных видов орхидных в искусственных условиях ex situ могут быть: - создание коллекций живых растений [1,2]; -создание банков зародышевой плазмы в виде семян, меристем, пыльцы, культур клеток, культур тканей и другого генетического материала [3-8].
Массовое семенное размножение орхидных традиционным способом (посев на земельные субстраты) мало осуществимо из-за облигатного симбиотрофизма начальных стадий их прорастания, поэтому семенное размножение представителей этого семейства осуществляется, в основном, в асимбиотической культуре in vitro на питательных средах. За последние годы к затрудненно прорастающим семенам орхидных. был применен экологический подход, с помощью которого удалось преодолеть фазу биологического покоя у семян многих орхидных умеренной зоны и аридных областей Земли, обусловленную локализованными в семенной кожуре ингибиторами. Для этого использовали посев недозрелых семян, удаление ингибиторов специальными растворами и содержание посевов и проростков в условиях, максимально приближенных к реально существующим в природе (низкие температуры зимой, отсутствие света) [9, 10].
При проращивании семян орхидей в культуре in vitro и последующей пересадке развивающихся сеянцев на новые среды часто происходит непроизвольная селекция. Выбор особей для дальнейшего культивирования определяется по фенотипическим признакам и в зависимости от целей исследователя. Это могут быть одиночные протокормы, максимально быстро переходящие к гемморизогенезу, или конгломераты протокормов с дополнительными меристематическими центрами, способными к многократному почкованию, или аморфные каллусообразные тела, медленно нарастающие в культуре в течение многих лет.
Отбор растений с определенным фенотипом из посева маточников неизбежно приводит к обеднению генотипа в целом, причем, чем дольше сохраняется популяция, отобранная из гетерогенного посева, тем более гомогенной она становится. Особенно часто можно столкнуться с вырождающейся популяцией орхидных in vitro в случае отбора на максимальную продуктивность на стадии протокормообразования. Чем дольше сохраняется в культуре in vitro такая популяция, тем менее жизнеспособными становятся производимые от нее растения-регенеранты.
Таким образом, депонирование редких орхидных ex situ в виде живых коллекций протокормов и каллусных культур неизбежно приводит к вырождению гетерогенных популяций. В качестве альтернативного пути сохранения генофонда орхидных, как редких и исчезающих растений, мы исследовали возможность долговременного сохранения семян и протокормов в криобанке при температуре жидкого азота.
Зрелые семена орхидей самой своей природой прекрасно подготовлены к длительному хранению в жидком азоте. Они имеют слабо дифференцированный зародыш, нередко состоящий всего из нескольких клеток, обладают изначальной низкой влажностью, небольшими размерами (250-1500 мкм в длину, 270-990 мкм в ширину), тонкой сетчатой семенной кожурой и практически полным отсутствием эндосперма [11].
В данной работе мы использовали зрелые семена, которые проращивали на агаризованной безгормональной питательной среде (1/2 MS) в темноте при 25-26 °С. Замораживали семена в полиэтиленовых ампулах, быстро погружая их в жидкий азот. Хранили в крио-банке
7-30 дней. Ампулы оттаивали в воде при 41 °С в течение 30 с. Протокормы замораживали в пластиковых соломках (диаметр 2, длина 132 мм) после обработки нагружающим и витрифицирующим растворами. В качестве последнего применили PVS2PEg - {plant vitrification solution 2): 30 % глицерина + 15 % ПЭГ-6000 +15 % диметилсульфоксида (ДМСО) + 13,7 % сахарозы. Соломки оттаивали также в воде в течение 2-5 с. После оттаивания и отмывки от PVS2 протокормы культивировали в течение 180 суток на среде Fast [12] при 23 ± 1 °С на свету: 8000 люкс, 16 ч/сут. Результаты представлены в таблицах 1, 2.

Таблица 1
Характеристика семян и их всхожесть до и после криосохранения

Примечание: LN - жидкий азот.
Характеристика протокормов Dactylorhiza fuchsii Soo и их рост до и после криосохраиения в жидком азоте

Примечание: исходный средний размер протокормов 1200 мкм. LN - жидкий азот. PVS2 - (plant vitrification solution 2) витрифицирующий раствор. Культивирование - 180 сут. на свету.
Современные технологии вполне позволяют создавать криобан- ки не только семян, но и протокормов и культур меристем и клеток орхидных, но на этом поприще еще делаются только первые шаги [13, 14, 15]. Эта задача становится еще более значимой, если поставить перед собой цель долговременной криоконсервации наиболее выдающихся сортоклонов, которые сохраняют свой генотип только на соматическом уровне. Если сравнить количество природных видов орхидных (19,5 тыс. официально зарегистрированных видов и предположительно 10 тыс. видов в природе, еще не описанных) с количеством искусственно созданных гибридов (более 100 тыс. официально зарегистрированных таксонов) [16], то необходимость масштабного применения метода криоконсервации культур протокормов и меристем может возрасти в десятки и сотни раз.
Литература

1. Коломейцева Г.Л., Кузнецов А.Н. Интродукционная оценка орхидных флоры Вьетнама в Фондовой оранжерее ГБС РАН / Материалы VI междунар. науч. конф. // Охрана и культивирование орхидей. - Харьков, 2003. - С. 67-69.
2. Буюн Л.1. Охорона ex situ орхщей (Orchidaceae Juss.) флори Вьетнаму // Бюл. Никит. ботан. саду. - 2003. - Вин. 88. - С. 29-34.
3. Тихонова В.Л. Долговременное хранение семян дикорастущих видов растений. Банки: сбор материала, документация, методики, режимы. - Пушино: Пущинский научный центр РАН, 1999. - 20 с.
4. Тихонова В.Л. Долговременное хранение семян // Физиология растений, 1999.-Т. 46. - С. 467-476.
5. Тихонова В.Л., Смирнов И.А., Морозова И.В. Банки семян и работы по реинтродукции в ботанических садах// Бюл. отделения Междунар. совета ботан. садов по охране растений, 2001. - Вып. 12. -С. 90-94.
6. Молканова О.И., Горбунов Ю.Н. Сохранение редких и исчезающих растений в банке меристем ГБС РАН / Материалы III Междунар. науч. конф. // Биологическое разнообразие. Интродукция растений, СПб. - 2003. - С. 43-44.
7. Pritchard H.W. Liquid Nitrogen Preservation of Terrestrial and Epiphytic Orchid Seed // Cryoletters, 1984. V. 5. - P. 295-300.
8. Криогенное хранение семян некоторых тропических орхидных / Т. В. Никишина, А.С. Попов, Г.Л, Коломейцева, Б.Н. Головкин // Докл. РАН, 2001. - Т. 378,-№4.-С. 555-557.
9. Проблемы и перспективы семенного размножения in vitro орхидных умеренной зоны / Е.В. Андронова, П.В. Куликов, Е.Г. Филиппов, В.Е. Васильева, Т.Б. Батыгина // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3. Системы репродукции / Под ред. Т.Б. Батыгина. - СПб.: Мир и семья, 2000.-С. 513-524.
10. Коновалова Т.Ю., Шевырева Н.А. Проращивание семян некоторых видов природных орхидей асимбиотическим методом in vitro / Тез.докл. междунар.конф. // Ботанические сады: состояние и перспективы сохранения, изучения, использования биоразнообразия растительного мира. - Минск, 2002. - С. 132-133.
11. Arditti J. Factors affecting the germination of orchid seeds // Bot. Rev. - 1967. - V. 33, N I. - P. 1-97.
12. Fast G. Nahrstoffanspruche tropischer Orchideen // Orchidee. - 1976. - V. 27, N l.-S. 17-23.
13. Попова E.B., Коломейцева Г.Л., Попов А.С. Культивирование меристем Phalaenopsis amabilis in vitro: Труды IV междунар. симпозиума // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. - М.: Изд-во Рос. ун-та дружбы народов, 2001. - Т. 1. - С. 388-390.
14. Влияние криоконсервации семян на развитие протокормов гибридной орхидеи Bratonia II Е.В. Попова, Т.В. Никишина, Г.Л. Коломейцева, А.С. Попов // Физиология растений. - 2003. - Т. 50. - N 5. - С. 750-755.
15. Способы криосохранения и криобанк клеток, меристем и семян растений / А.С. Попов, Т.В. Никишина, О.Н. Высоцкая, Е.В. Попова. Г.Л. Коломейцева // Цитология, 2004. - Т. 46. - N 9. - С. 839 - 841.
16. Pridgeon A. (ed.) The Illustrated Encyclopedia of Orchids. Portland, Oregon: Timber Press, 1998. - 304 p.