ДИАГНОСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ И РАЗРАБОТКА ОБЪЕКТИВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРИ ОТБОРЕ СЕЯНЦЕВ ВИНОГРАДА
П. Я. ГОЛОДРИГА, В. А. ДРАНОВСКИЙ, Л. К. КИРЕЕВА, Н. А. КРАВЧЕНКО, И. Л. СУЯТИНОВ
В результате генеративной гибридизации селекционерами—виноградарями повсеместно создан обширный гибридный фонд. Оценка же при отборе сеянцев винограда по ряду признаков ведется субъективно, что в конечном счете значительно затягивает сроки селекционного процесса.
С 1956 г. в отделе селекции института «Магарач» ведутся исследования по установлению корреляционной зависимости между развитием отдельных признаков и сопутствующими им объективными физиолого-биохимическим и биофизическим показателями.
Организуя эти исследования, мы исходим из того, что растениям свойственны закономерности, характеризующие их как сложную саморегулирующуюся открытую систему с присущей ей биологической специфичностью, которая определяется генотипом, во взаимодействии с окружающей средой.
Сорта винограда вида Vitis vinifera L., как установлено длительными эмпирическими наблюдениями, отличаются между собой биологическими и хозяйственно ценными признаками (морозоустойчивостью, раннеспелостью, устойчивостью к болезням, качеством продукции), в чем и состоит их биологическая специфичность. Биологическая специфичность сортов винограда определяется комплексом физиолого-биохимических процессов и биофизических взаимодействий, составляющих в целом обмен веществ. Установив путем изучения в годичном цикле развития индикаторных сортов наиболее характерные особенности в обмене веществ, можно будет заниматься диагностикой определенных биологических и хозяйственно ценных признаков у сеянцев.
Известно, что изменениям в химическом составе предшествуют сдвиги в направлении деятельности ферментов. Так как биологическим катализаторам в обмене веществ придается исключительно большая роль, было естественным обратиться в первую очередь к изучению ферментов. На первом этапе исследований изучали активность ферментов у различных по полу сортов винограда.
При биохимической характеристике пола особое значение придавали окислительно-восстановительным процессам [11, 15]. Активность пероксидазы определяли методом А. Н. Бояркина [4], активность полифенолоксидазы — манометрическим методом.
Установлено, что у сортов с женским типом цветка активность пероксидазы и полифенолоксидазы выше, чем у обоеполых. Например, активность пероксидазы листьев (в условных единицах) в сентябре 1957 г. у обоеполых сортов Кишмиш черный—0,11, Мускат белый слабая, у сортов же с женским типом цветка Мадлен Анжевин—1,17, Чауш—1,10. Активность полифенолоксидазы листьев (в мл О2, поглощенного 1 г ткани за 30 мин в сентябре 1959 г. у винограда сортов Кишмиш черный — 0,2 и Мускат белый 0,6, а у сортов Мадлен Анжевин -1,6 и Чауш — 2,3.
Получив данные по активности ферментов у сортов, принадлежащих к различному полу, мы задались целью изучить с точки зрения отдельных физиолого-биохимических и биофизических показателей различные по степени морозоустойчивости индикаторные сорта винограда. Такую цель давно ставят перед собой ученые. В достижении этой цели особенно заинтересованы селекционеры. К сожалению, биологическая наука не располагает теорией, исчерпывающе объясняющей сущность морозоустойчивости. В связи с этим работа по определению морозоустойчивости виноградного растения была построена на установлении показателей, коррелирующих с морозоустойчивостью (активность ферментов, соотношение форм воды, электропроводность и т. д.).
Из данных ряда исследователей [2, 3, 20] известно, что активность ферментов у растений в зависимости от их степени морозоустойчивости различна. На первом этапе наших исследований изучалась активность каталазы и пероксидазы у индикаторных сортов винограда. Активность каталазы определяли по методике, описанной М. А. Дрбоглавом [6]. Серией методических опытов установлено, что наиболее четкая разница в активности ферментов обнаруживается осенью (табл. 1).
Как видим из данных табл. 1, морозоустойчивый сорт Таежный изумруд и относительно морозоустойчивые сорта Ркацители, Рислинг, Мадлен Анжевин, Саперави, Португизер отличаются повышенной активностью пероксидазы, тогда как типичные неморозоустойчивые copтa Катта курган, Нимранг, Мускат белый—пониженной активностью этого фермента. Однако у неморозоустойчивого сорта Тайфи розовый отмечена повышенная активность пероксидазы.
Таблица 1
Активность пероксидазы и каталазы луба и древесины виноградного растения (Южный берег Крыма, сентябрь — октябрь 1963—1964 гг.)
По активности каталазы разница между сортами различной степени морозоустойчивости установлена более четко.
Результаты анализов активности этих же ферментов у сеянцев и некоторых сортов приведены в табл. 2. Морозоустойчивые сеянцы Магарач № 16—51—69, 41—51—47, 41—51—64 выделяются повышенной активностью ферментов.
Таблица 2
Активность пероксидазы и каталазы луба и древесины у сортов и сеянцев винограда (Степное опытное хозяйство института «Магарач», ноябрь 1965 г.)
Достаточно четкая разница в активности ферментов в условиях степного Крыма установлена на индикаторных сортах (см. табл. 2).
Таким образом, по активности ферментов в лубе и древесине в определенное время вегетации можно отметить тенденцию к повышению активности их у сортов с повышенной морозоустойчивостью (исключением является Тайфи розовый).
Более определенный вывод по другим культурам о существовании связи между активностью ферментов и морозоустойчивостью делают Л. В. Благовещенский [3], Η. М. Сисакян и Б. А. Рубин [20].
Некоторые исследователи [16, 19, 22, 26, 27], изучавшие различные виды растений с точки зрения морозоустойчивости, отметили определенную связь между морозоустойчивостью растений и содержанием форм воды в тканях.
В жизни растения вода играет исключительно важную роль не только как составная часть клеток, но и как среда, в которой протекают все процессы, обеспечивающие нормальную жизнедеятельность его.
Л. Сент-Дьердьи [18] предполагает, что вода составляет единую систему со структурными элементами, в которых становятся возможными электронные возбужденные состояния; она является неотъемлемой частью жизненной машины; водные структуры и их взаимодействия с электронными возбуждениями тесно связаны с самой сущностью «живого состояния». «Изучение воды в связи с ее биологической структурой и процессами электронного возбуждения открывают увлекательную и многообещающую область исследований, которая возможно поведет нас далеко в понимании нормальных и патологических процессов жизни» [18].
Как известно, вода в растении связана в той или иной степени. Различают в основном две формы воды — слабосвязанную и прочносвязанную. Термины свободная и связанная вода не вполне соответствуют новым понятиям о состоянии воды в тканях, но и в настоящее время они используются для сравнительной характеристики сопоставляемых растений при воздействии на ткани определенной водоотнимающей силы.
От соотношения свободной и связанной воды в растительных тканях, как указывает ряд авторов [16, 19], зависит ход различных физиологических процессов в них и устойчивость растений к неблагоприятным условиям.
Эмпирическим путем виноградарями в различных зонах возделывания винограда установлено, что наиболее высокой морозоустойчивостью обладает вид Vitis arnurensis R., межвидовой гибрид Альфа (Vitis 1 abrusca L. и Vitis riparia Mich.) и др.
По степени морозоустойчивости сорта вида Vitis vinifera L., принадлежащие к различным эколого-географическим группам, также неодинаковы. Особенно убедительно это показано многолетними исследованиями И. Н. Кондо [9]. Для изучения состояния форм воды у различных по степени морозоустойчивости сортов винограда нами в качестве индикаторных были исследованы следующие морозоустойчивые и относительно морозоустойчивые сорта Альфа, Рислинг, Саперави, Ркацители, Тагоби, Португизер и неморозоустойчивые — Халили белый, Мускат белый, Нимранг, Тайфи розовый, Хусайне. Состояние воды в тканях определяли по принципу А. В. Думанского [7] и методике А. Ф. Маринчик [10].
Суть методики по определению форм воды сводится к тому, что для тканей растений характерна отдача воды клетками при взаимодействии с гипертоническим раствором сахарозы. По состоянию воды в тканях можно судить о морозоустойчивости при воздействии на ткань определенной водоотнимающей силы. При этом особо отмечаем, что в отличие от ряда других исследователей мы в своей работе делаем выводы не по количеству связанной воды, а по отношению связанной воды к свободной. Бывают случаи, когда количество связанной воды у морозоустойчивых и неморозоустойчивых сортов одинаково, но свободной воды всегда больше у неморозоустойчивого сорта. Поэтому более важно не абсолютное количество связанной или свободной воды, а их соотношение.
Методическими исследованиями установлено, что в процессе вегетации соотношение форм воды в лубе и древесине, а также в зеленой массе изменяется.
Таблица 3
Формы воды, их соотношение в лубе и древесине (в % на сырое вещество) у индикаторных сортов винограда в зимний период 1962—1965 гг. (Южный берег Крыма).
Таблица 4
Формы воды, их соотношение в лубе и древесине у сортов и сеянцев винограда (в % на сырое вещество) (Степное опытное хозяйство института «Магарач»)
Наиболее контрастные данные по этому показателю в лубе и древесине вызревшего побега у сортов с различной степенью морозоустойчивости установлены в осенне-зимний период. Поэтому все массовые исследования выполнялись в это время.
В табл. 3 приводятся данные за 4 года о содержании форм воды, их соотношении у индикаторных сортов винограда, различающихся по степени морозоустойчивости.
Даже без математической обработки видно, что сорта с различной степенью морозоустойчивости различаются между собой по состоянию воды, но особенно это отчетливо проявляется в показателях отношения связанной воды к свободной. Например, у сорта Альфа за 1962, 1963, 1964, 1965 г. соотношение форм воды составляет 8,2; 6,9, 9,3; 9,2, а у Хусайне в те же годы соответственно 0,6; 1,0; 3,9, 1.1. Сорт Тербаш вначале нами был включен в группу с пониженной морозоустойчивостью, однако, исходя из данных лабораторных исследований и полевых наблюдений, он должен быть отнесен в первую группу с относительно повышенной морозоустойчивостью. Наши наблюдения над сортом Тербаш соответствуют выводам об этом сорте И. Н. Кондо [9].
Убедившись, что величина отношения форм воды коррелирует со степенью морозоустойчивости у сортов винограда, мы выполнили серию анализов на сеянцах, выделенных из комбинаций скрещиваний для получения морозоустойчивых сортов. Морозоустойчивость этих сеянцев не была известна.
В табл. 4 приводятся данные по состоянию воды в лубе и древесине у сортов и сеянцев винограда.
Как следует из данных табл. 4, разница между различными гибридными формами по состоянию воды весьма существенна.
Таблица 5
Сохранность глазков побегов открыто зимовавших кустов сеянцев и сортов винограда в условиях степного Крыма (Степной опорный пункт ВНИИВиВ «Магарач»)
Лабораторные данные дали нам основание еще осенью 1962 г. полагать и о различной степени их морозоустойчивости. Для установления соответствия прогноза с практической устойчивостью гибридных форм к морозу кусты исследуемых форм оставались неукрытыми. Абсолютный минимум зимой 1962/63 г. достигал —24, —26° С.
Изучая сохранность глазков по длине побега, установили, что степень гибели их у сеянцев неодинакова, о чем свидетельствуют данные табл. 5.
Сопоставляя данные табл. 5 с данными по состоянию воды в тканях сеянцев винограда (см. табл. 4), нетрудно убедиться, что сеянцам, у которых морозом меньше всего повреждены глазки, соответствует более высокий показатель соотношения форм воды. Причем по годам абсолютный уровень по этому показателю изменяется.
Для выявления корреляции между соотношением форм воды и морозоустойчивостью у других видов растений нами проводились исследования1 на различных видах и сортах цитрусовых (Citrus), рябине (Sorbus aucuparia L.), инжире (Ficus carica L.), ленкоранской акации (Albizzia Julibrissin).
В табл. 6 приводятся данные по состоянию форм воды, полученные на различных видах растений.
Таблица 6
Состояние форм воды в побегах (в % на сырое вещество) у различных видов растений в осенне-зимний период 1964—1965 гг. (Южный берег Крыма)
Анализ данных табл. 6 показывает, что исследуемые растения значительно различаются между собой по соотношению форм воды, что находится в соответствии с присущей данным генотипам степенью морозоустойчивости.
Итак, в результате четырехлетнего изучения индикаторных сортов и сеянцев винограда, а также других видов растений, обладающих различной степенью морозоустойчивости, установлено, что по соотношению форм воды они значительно различаются между собой. Использование описанного метода позволяет селекционерам заниматься диагностикой морозоустойчивости, а агротехникам, по-видимому, устанавливать влияние различных приемов на морозоустойчивость виноградного растения. На научно-методическом совещании по физиолого-биохимическим методам исследования в виноградарстве, которое проходило в г. Ялте в 1965 г., отделом селекции предложена методика для диагностики морозоустойчивости сортов и сеянцев винограда. (Материалы этой конференции находятся в печати).
Объектом исследования послужил материал из Государственного Никитского ботанического сада, представленный нам А. А. Рихтером и В. А. Шолоховой.
Кроме оценки морозоустойчивости растений по соотношению форм воды, активности ферментов в вегетативных органах, нами, начиная с 1963 г., параллельно выполнены исследования по определению электропроводности ткани при использовании слабых токов высокой частоты
В последнее время у нас и за рубежом опубликован ряд работ по изучению состояния ткани растения посредством электропроводности [1, 5, 14, 21, 23, 24, 25]. Исследованиями было установлено, что электропроводность, измеряемая при помощи токов определенной частоты, в живой ткани в несколько раз ниже, чем в мертвой.
Использование электрометрических приборов для изучения состояния растительной ткани имеет целый ряд преимуществ, главным из которых является то, что они позволяют исследовать нормально функционирующую ткань, а не гомогенат, как это делается при физиологобиохимических исследованиях.
Приступая к выполнению этого исследования, мы полагали, что растительная ткань является для токов определенной частоты сложным комплексом сопротивлений. Электропроводность ткани определяли на приборах, выполненных по нашей просьбе физиком И. А. Баберским п сотрудником института «Магарач» Μ. Ф. Коневецким2.
В 1966 г. при исследованиях применяются уже не две частоты, а пять разных частот (500, 1000, 2000, 10000 и 106 гц)3.
На первом этапе изучали электропроводность вегетативных органов винограда упомянутых выше индикаторных сортов с различной степенью морозоустойчивости.
В табл. 7 приводим данные, полученные при пропусках токов частотой 104 и 106 гц, комплексного и активного сопротивлений у различных по морозоустойчивости сортов винограда.
Таблица 7
Данные по комплексному и активному сопротивлениям ткани индикаторных сортов винограда (Степное опытное хозяйство института «Магарач», ноябрь 1965 г.)
1Анализы выполнила старший лаборант отдела селекции Л. И. Лопатина.
2 Прибором, сконструированным И. А. Баберским, определяются комплексное сопротивление и угол фазового сдвига; прибором, сконструированным Μ. Ф. Коневецким, - сопротивление и емкость.
3 Прибор, обеспечивающий измерение при токах 500, 1000 и 2000 гц, сконструирован Одесским политехническим институтом для отдела химии вина ВНИИВиВ " Магарач".
Из экспериментальных данных, приведенных в табл. 7, следует, что сопротивление ткани 1 морозоустойчивых сортов (Амурский обоеполый, Саперави Северный) и относительно морозоустойчивых (Ркацители, Саперави, Португизер, Тербаш) существенно отличается от этого же показателя у неморозоустойчивых сортов (Нимранг, Хусайне, Мускат белый).
Нами исследованы и сеянцы, различные по степени морозоустойчивости (табл. 8).
Таблица 8
Данные об электропроводности ткани гибридных форм (Степное опытное хозяйство института «Магарач», ноябрь 1965 г.)
Из данных табл. 8 следует, что по сопротивлению ткани сеянцы так же, как и индикаторные сорта (см. табл. 7), значительно между собой различаются. Сопоставление экспериментальных данных по одним и тем же сортам и сеянцам свидетельствует о сопряженности между соотношением форм воды, электропроводностью ткани и сохранностью глазков после перезимовки.
Из данных зарубежных исследователей [23, 25] известно, что после перезимовки степень повреждения тканей устанавливалась экспериментаторами с помощью электропроводности. Характерным отличием наших исследований является не констатация степени повреждения тканей морозом, а диагностика морозоустойчивости.
Итак, анализ полученных нами данных по электропроводности ткани различных сортов, а также результатов зарубежных исследований позволяет сделать вывод, что с помощью метода установления электропроводности ткани можно получить такие же достоверные данные по устойчивости растения к морозу, какие обеспечиваются длительными эмпирическими полевыми наблюдениями. Нам представляется, что в наше время, при значительных достижениях в области биохимии и биофизики, существующие методики качественных и количественных исследований отдельных показателей в гомогенате не являются идеальными.
Необходимо разрабатывать новые методы, позволяющие снимать объективные данные в нормально функционирующей ткани.
1 Электропроводность =
Кроме исследований по использованию объективных физиологобиохимических и биофизических показателей для диагностики биологических признаков, выполнена работа, связанная с установлением объективных показателей количественного содержания красящих веществ в ягодах винограда. Это позволит рационально вести подбор исходных форм и отбор лучших сеянцев по признаку накопления красящих веществ.
Антоцианы виноградной ягоды составляют 23% от общего запаса танидов и влияют на скорость созревания, вкусовой комплекс и окраску вина.
Многими исследователями [8, 12, 13] показано, что способность сорта накапливать красящие вещества — важнейшая его биологическая особенность.
В последние годы, красящие вещества винограда применяются в пищевой промышленности, например, как энокраситель для кондитерских изделий [9, 17].
Скрещивания, имеющие своей целью увеличение в ягодах новых сортов количества красящих веществ, данные об их количестве в ягодах свидетельствуют о значительном варьировании этого признака у сеянцев F1. Для выделения лучших из них по признаку накопления красящих веществ требуется объективный метод отбора. На основе фотометрического принципа определения интенсивности окраски растворов применительно к селекционным целям разработан следующий метод. Сеянцы отбираются по содержанию красящих веществ в единице веса ягод (100 г). Методика доложена на совещании по физиологобиохимическим методам исследования в виноградарстве в 1965 г. (рукопись в печати). Если необходимо провести первичный отбор среди множества сеянцев, определение красящих веществ проводится в один срок - при сахаристости сока ягод 19—20%. Количество красящих веществ при необходимости определяется отдельно в соке и в кожице.
Исследуя содержание красящих веществ в исходных сортах и сеянцах винограда, мы выявили, что по признаку содержания красящих веществ в соке ягод сеянцев, полученных от внутрисортового скрещивания Саперави X Саперави и Каберне-Совиньон X Каберне-Совиньон, сохраняется сортовая типичность (табл. 9).
Таблица 9
Содержание красящих веществ в ягодах некоторых сортов и сеянцев (Степной опорный пункт института «Магарач»)
Изучение наследования признака накопления красящих веществ при межсортовом скрещивании Саперави X Каберне-Совиньон показывает, что гибридное потомство в этом случае уклоняется в сторону родителя с меньшей выраженностью этого признака.
В процессе изучения вопросов, связанных с накоплением красящих веществ в ягоде винограда, установлено, что их содержание варьирует по годам. В соответствии с нашими данными это варьирование зависит от температурного режима в период созревания, нагрузки кустов урожаем и кислотности сока ягод.
ВЫВОДЫ
Активность ферментов (пероксидаза, полифенолоксидаза) значительно выше у сортов с функционально женским типом цветка. У морозоустойчивых сортов винограда установлена тенденция к повышенной активности каталазы и пероксидазы.
- Более высокому отношению связанной воды к свободной в лубе и древесине соответствует и больший процент сохранности глазков после перезимовки. Показатель отношения связанной воды к свободной может быть использован в селекции для диагностики морозоустойчивости сортов и сеянцев.
- Исследованиями электропроводности тканей вегетативных органов индикаторных сортов и сеянцев винограда, а также других видов растений при помощи слабые токов высокой частоты установлена корреляционная зависимость между комплексным и активным сопротивлениями и морозоустойчивостью. Экспериментальные, а также литературные данные позволяют рекомендовать этот метод как экспрессметод для установления степени повреждения ткани морозами, а также для диагностики морозоустойчивости сеянцев.
- Применение объективного метода оценки исходных форм и сеянцев по признаку накопления красящих веществ будет способствовать совершенствованию селекционного процесса в виноградарстве.
- Между биологическими признаками растения винограда и объективными физиолого-биохимическими и биофизическими показателями существует определенная корреляция. В дальнейшем очень важно аналогичные исследования выполнять по единой методике, на одних и тех же видах и сортах растений в различных экологических условиях. Использование этих методов при отборе сеянцев значительно ускорит селекционный процесс.
По-видимому, физиолого-биохимические и биофизические показатели могут быть использованы агротехниками в работе для установления влияния различных приемов на состояние виноградного растения.
Публикуется по сборнику: Виноградарство и виноделие
Труды, том 16, Москва 1967
