Дрожжевые грибы на ягодах винограда Дагестана

Дрожжевые грибы на ягодах винограда Дагестана*
Е.С. МАГОМЕДОВА, канд. биол. наук; Д.А. АБДУЛЛ АБ ΕΚΟΒΑ, канд. техн. наук;
А. В. КАЧАЛКИН, канд. биол. наук; Г.Г. МАГОМЕДОВ
ФГБУН «Прикаспийский институт биологических ресурсов» ДНЦ РАН
Ключевые слова: дрожжи, ягоды винограда, Saccharomycescerevisiae, биотехнология, экология, 26SрДНК
Key words: yeast, grape fruit, Saccharomyces cerevisiae, biotechnology, ecology, 26S rDNA

Наиболее типичной средой обитания дрожжевых грибов и источником выделения различных видов служат природные субстраты, характеризующиеся высоким содержанием легкодоступных питательных веществ (сахара). Один из таких субстратов, с которого и началось развитие науки о дрожжах, — ягоды винограда.
За последние несколько десятилетий представление о границах дрожжевой группы претерпело существенную эволюцию, главной особенностью которой является переход от таксономического содержания понятия дрожжи к экологическому. Сейчас постоянные или индуцируемые одноклеточные ассимилятивные формы классифицируются в нескольких порядках аскомицетовых и баз идиомицетовых грибов [1]. Современный период исследования дрожжей характеризуется интенсивным развитием филогенетической систематики, основанной на сравнительном изучении нуклеотидных последовательностей консервативных участков ДНК [2].
Хорошо известно, что зрелые ягоды винограда отличаются разнообразием качественного состава дрожжей и богатым источником видов, представляющих интерес для биотехнологии, в том числе бродильных производств. После всплеска работ, касающихся вопросов обитания дрожжей в условиях виноградников, наблюдаемого в России и странах бывшего СССР в 50-70-х годах XX в., количество публикаций, содержащих результаты таких исследований, у нас в стране к настоящему времени практически сведено на нет.
В течение 2001-2011 гг. мы исследовали дрожжевое население, обитающее на ягодах винограда, произрастающего на территории Дагестана, который благодаря своему географическому положению и горному рельефу с хорошо выраженной высотной поясностью представляет чрезвычайное разнообразие ландшафтов, обусловливающих специфические условия существования биоты в целом и отдельных ее компонентов.
Согласно вертикальной зональности, здесь выделяют низменную, предгорную, внутригорную и высокогорную зоны. Условная граница горной части (включая предгорья), составляющей 55 % территории республики, проведена по изогипсе 200 м над уровнем моря. Способность винограда произрастать в многообразных природных условиях равнины и предгорий позволяет выявлять особенности организации дрожжей в природе, что представляет интерес с точки зрения биогеографических исследований в области микроэкологии, получения сведений о биоразнообразии эукариотов и поиска новых полезных штаммов.
Цель работы — получение сведений, способствующих выявлению закономерностей формирования таксономического разнообразия дрожжей, особенностей их территориального распределения (в том числе с учетом высотно-поясной структуры ландшафтов), поиск штаммов, эффективных для биотехнологии.

Объекты и методы исследований. Объектом исследования были ягоды винограда сорта Ркацители, произрастающего в 5 виноградарских местностях, расположенных на территории низменного (34-50 м над уровнем моря) и 3 местностях предгорного (250-450 м над уровнем моря) Дагестана. В каждом биотопе виноградные грозди в течение 2-3 лет отбирали один раз в сентябре в период зрелости, когда их дрожжевой состав характеризуется наибольшим обилием. Грозди снимали в разных точках участка в равных количествах и смешивали для получения средней пробы. Из винограда средней пробы извлекали сок непосредственно на местах сбора, который разливали в 0,5-литровые стерильные бутылки и в тот же день доставляли в лабораторию. Собирали виноград и извлекали сок из ягод с соблюдением необходимых по микробиологии мер стерильности с целью инфицирования его только дрожжами, обитающими на их поверхности.
Для выделения дрожжевых культур использовали метод накопительных культур, применение которого было обусловлено тем, что стандартные методы смыва и посева дрожжей в случае низкой численности в природных местообитаниях не всегда обеспечивают их выделение.
Для выявления всего спектра дрожжей высевы из накопительных культур производили на твердую питательную среду виноградное сусло- агар в чашках Петри в динамике до начала спонтанной ферментации, а с ее началом — каждые 3-4 сут до полной остановки процесса. Образцы высевали в 3-5 повторностях, посевы инкубировали при комнатной температуре в течение 5-7 сут. Выросшие колонии дрожжей с помощью бинокулярной лупы разделяли на морфологические типы, 2-3 колонии каждого типа выделяли в чистую культуру. Выводы. Внедрение в широкую практику предлагаемых субстратов даст возможность получать значительно большее количество качественных саженцев с площади теплиц, снизить их стоимость. Использование тепла и влаги для роста и развития растений в условиях регулируемой среды, благоприятный термический режим субстрата

Выводы. Внедрение в широкую практику предлагаемых субстратов даст возможность получать значительно большее количество качественных саженцев с площади теплиц, снизить их стоимость. Использование тепла и влаги для роста и развития растений в условиях регулируемой среды, благоприятный термический режим субстратажи до рода, а сахаромицеты — до вида, руководствуясь определителями и пособиями [3, 4].
Для выявления таксономического статуса отдельных природных изолятов использовали анализ нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК. Выделение ДНК и проведение ПЦР производили по методике, описанной ранее [5, 6]. Для амплификации использовали праймеры ITSlf (5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA) и NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGA- CGG). Секвенирование амплифицированного региона производили в НПК«Синтол» (Москва).

Филогенетическое положение штамма S. cerevisiae (№2) полученное методом максимальной экономии (MaximumParsimonyanalysis) на основании выравненных нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов 26S рДНК. Номера, данные над разветвлениями, соответствуют частоте (> 55%) соединения таксонов при 1000 построений. Шкала показывает число замен на длину используемых для анализа нуклеотидных последовательностей (567 п. н.). U72163 Zygosaccharomycesrouxii NRRL Y-229T - скрытая внешняя групп

Таблица 1

Филогенетическую идентификацию осуществляли с использованием данных ген- банка NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Полученную нуклеотидную последовательность D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК для одного из опытных штаммов Saccharomycescerevisiae использовали для построения филогенетического дерева (см. рисунок). Филогенетический анализ выполняли с помощью программ MAFFT 6 и MEGA4.
При исследовании физиологобиохимических свойств дрожжей S. cerevisiae акцент сделали на изучении способности культур к продуцированию и трансформации компонентов, количество и соотношение которых могут определять качество вина. Объектом исследования выбрали природные штаммы из коллекции лаборатории, предварительно отобранные как потенциально перспективные по ряду признаков (скорость забраживания сусла и осветления сброженных субстратов, структура дрожжевого осадка, энергия брожения). Эти культуры исследовали в сравнении с производственно-ценными штаммами, используемыми в виноделии — Дербентская-74 (Д-74) — А. С. СССР №1446353,1973 и Махачкалинская-12Х (М-12Х) — А. с. СССР №1104149,1984, полученными в результате направленной селекции. Двухсуточные дрожжевые разводки инокулировали в количестве 3 млн/см³ в стерильный виноградный сок, брожение проводили до естественной остановки при 25...27 °C. В сброженных субстратах определяли концентрацию этанола, летучих кислот, титруемых кислот, остаточных сахаров, средних эфиров в соответствии с действующими ГОСТами [7]. Комплекс летучих компонентов определяли на газовом хроматографе «Кристалл-200М» с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке НР- FFAP (50 мх0,32 мм) с 10%-ным диэтленгликольсукцинатом, газ-носитель — азот (1,8-2,7 дм/ч3).
При изучении влияния температуры на дрожжи S. cerevisiae культуру выращивали при 27 и 37 °C, находящихся в пределах и вне оптимума, характерного для их роста в аэробных условиях. Методика постановки опыта описана ранее [8].

Результаты и их обсуждение. Анализ полученных данных показал, что за годы исследований состав дрожжевого населения, изолированного с виноградных ягод всех местностей, включал представителей дрожжей в основном аскомицетового аффинитета, отнесенных к родам Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, Torulopsis, Debaryomyces, Candida, и один анаморфный род базидиомицетового аффинитета — Rhodotorula(табл. 1). Род Torulopsis, включенный ныне в род Candida [4], идентифицирован и выделен отдельно согласно определителю Лоддер [3] в связи с тем, что он традиционно упоминается в литературе по микробной энологии [9].

Учет дрожжевых группировок на плодах из различных местностей показал повсеместное присутствие представителей Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, реже встречались таксоны Torulopsis и Debaryomyces — соответственно в 7 и 5 районах. К спорадически встречающимся таксонам можно отнести дрожжи рода Candida, выделенные на двух участках, где визуально отмечали большое количество ягод, зараженных фитопатогенами, и дрожжи рода Rhodotorula, изолированные за период исследований из одного района, существенно отличающегося теплообеспеченностью.
Анализ встречаемости таксонов по годам выявил, что регулярное присутствие в дрожжевом сообществе всех равнинных и предгорных местностей характерно для апикулятусов, а в равнинных биотопах их спектр дополняли сахаромицеты. Полученные данные позволяют отметить тенденцию к снижению таксономического разнообразия дрожжей по равнинно-предгорному профилю, поскольку за 5 лет исследований не были обнаружены представители родов Rhodotorula и Candida, диагностированные в комплексе дрожжей, обитающих на ягодах равнины.
Таким образом, приуроченность дрожжей к ягодам винограда и их изменчивость в определенных экологических условиях может иметь специфическое проявление. Очевидно, это связано с тем, что дрожжи, обитающие на гроздях винограда, могут подвергаться воздействию температуры, влажности, инсоляции, анатомического строения и состава экссудатов растения, взаимоотношений внутри микробного сообщества, так как исследователи отмечают, что филлоксера по отношению к микроорганизмам является достаточно неоднородной и экстремальной средой обитания [10].
Данные анализа нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК отдельных штаммов, идентифицированных ранее по фенотипическим признакам до рода, позволили выявить присутствие в дрожжевом сообществе ягод винограда видов Pichiakudnavzevii, Pichiaguilliermondii, Candidamembranifaciens, Hanseniasporawcarum и Saccharomycescerevisiae.
Принятый нами методологический подход при изучении дрожжей винограда (разовый отбор проб и использование метода накопительных культур) не позволяет дать полную картину их формирования и функционирования, употреблять термины количественной синэкологии — общее количество дрожжей, минорные и доминирующие виды, постоянные обитатели (субстратные виды). Кроме того, известно, что специфичность сообщества дрожжевых грибов в различных биогеоценозах заключается не столько в валовых, инвентаризационных характеристиках (численность, состав), сколько в характере вертикальной структуры, степени вертикальной дифференцированности сообщества (характер распределения численности в пространственносукцессионных рядах, дифференцирующее разнообразие) [И]. В связи с этим считаем целесообразным продолжить изучение разнообразия дрожжевых сообществ винограда на основе вертикально-ярусного подхода, включающего одновременный отбор образцов из различных биогеоценотических ярусов (живое растение, опад, почва) в онтогенезе растения с привлечением для идентификации метода анализа нуклеотидных последовательностей, широко используемого в современной систематике дрожжей.
Выделение синантропного вида S. cerevisiae на ягодах винограда, встречаемость которого чаще ограничена бродильными производствами, позволило изучить природные штаммы в таксономическом и эко- биотехнологическом аспектах.
Анализ нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК этой культуры подтвердил принадлежность к виду S. cerevisiae, идентифицированному ранее по фенотипическим признакам (см. рисунок).
При изучении физиолого-биохимических свойств штаммов S. cerevisiae основное внимание уделяли функциональным, характеризующим их метаболизм и одновременно отражающим практическую ценность штаммов. Опыты ставили на 10 штаммах S. cerevisiae, выделенных на различных местностях. Штаммы инокулировали в стерильный виноградный сок с массовой концентрацией сахаров 20,7 г/100 см³ и титруемых кислот 7,6 г/дм³. После естественной остановки брожения в них определяли этиловый спирт, остаточные сахара, летучие и титруемые кислоты, средние эфиры, ацетальдегид, высшие спирты. Параллельно проводили ферментацию этого сока на штаммах М-12Х и Д-74, выбранных в качестве контрольных.
Результаты изучения состава сброженных материалов показали, что содержание измеряемых показателей в субстратах, полученных с участием опытных штаммов, варьировали (очевидно, это связано с проявлением индивидуальных свойств культур (табл. 2). Отдельные природные штаммы, как и контрольные, синтезировали максимально возможное из сброженных сахаров количество этилового спирта. Способность дрожжей к продуцированию спирта (основной продукт углеводного обмена) — важное свойство, по которому отбирают культуру в виноделии. Отмечено повышение титруемых кислот во всех опытных вариантах и в одном из контрольных. В целом значения исследованных показателей во всех опытных образцах находились в пределах, допустимых для качественных натуральных вин, что свидетельствует о встречаемости на ягодах винограда, культивируемого в различных природных условиях, дрожжей-бродильщиков, сравнимых по физиолого-химическим свойствам с эффективными штаммами, применяемыми в биотехнологии.

Известно, что важным природным фактором, способным оказать селекционирующее влияние на популяцию дрожжей, является температура окружающей среды. Дрожжевые грибы — эволюционно сложившаяся группа мезотермофилов, большинство из которых способны развиваться при 0...5 °C, с наибольшей скоростью растут при 20...30 °C и имеют максимальную температуру, при которой рост прекращается, в пределах 30...40 °C.
В связи с этим наибольший интерес представляли дрожжи-сахаромицеты, выделенные из микрорайона, расположенного в окрестности бархана Сарыкум — известного памятника природы на Кавказе, отличающегося высокой теплообеспеченностью. Температурный режим воздуха формируется здесь под воздействием песчаной горы из кварцевого песка и супесчаной почвы, содержащей около 90 % кремнезема, являющихся в летнее время мощными аккумуляторами тепла. Сумма активных температур в среднем достигает 4100 °C, что на 350...400 °C выше характерной для большинства виноградовинодельческих местностей Дагестана. Получая большое количество тепла, виноградное растение формирует ягоды с повышенным содержанием углеводов, свободных аминокислот и других биологически активных веществ, определяющих качество винограда как сырья для производства элитной винодельческой продукции и как субстрата для дрожжей.
При тестировании изолятов из этой местности на устойчивость к повышенной температуре выделены штаммы, способные сохранять достаточно высокую биохимическую активность при 37 °C, то есть при температуре, находящейся вне оптимума, отмечаемого как для брожения, так и роста дрожжевых клеток, что позволяет рассматривать их в качестве потенциально-перспективных для селекции термотолерантных штаммов.
Изучение способности этих культур к размножению при 27 и 37 °C показало, что при повышенной температуре эллипсовидная форма клеток, характерная для сахаромицетов, меняется на округлую, почти шаровидную. Активный рост дрожжей (штамм №2) отмечен в обоих вариантах, однако при повышенной температуре он несколько отставал и через 48 ч составил 193,7 (при 27 °C) и 127,3 (при 37 °C) млн кл./см³. По литературным данным, у винных дрожжей количество клеток при 27 °C за такой период было больше в 5-7 раз, чем при 37 °C, то есть наблюдалось явное торможение функции размножения при повышенной температуре, и только длительная адаптация к ней позволила клеткам размножаться с одинаковой скоростью при этих температурах.

Выводы. Результаты исследования дрожжей S. cerevisiae из различных биотопов свидетельствуют о целесообразности дальнейшего поиска природных форм, метаболический статус которых представляет интерес для бродильных производств и получения дрожжей как целевого продукта.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бабьева И.П. Биология дрожжей/И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. — М.: Товарищество научных изданий КМК. 2004. 221 с.
2. Kurtzman С.Р., Fell J.W. Yeast systematics and phylogeny — implications of molecular identification methods for studies in ecology. The Yeast Handbook (Eds.C. A. Rosa, G. Peter). Springer-Verlag, 2006. P. 11-31.
3. Ladder J. (ed). The yeast. A taxonomic study. Amsterdam — London. 1970. 658 p.
4. Kurtzman C.P., Fell J.W. (Eds.) The Yeasts, a taxonomic study. Fourth Revised and enlarged edition. Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1998. 1055 p.
5. Качалкин А.В. Новые данные о распространении некоторых психрофильных дрожжевых грибов в Московской области/А. В. Качалкин//Микробиология. 2010. Т. 79. №6. С. 843-847.
6. Абдуллабекова Д.А. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, выделенные с плодов абрикоса (Prúnus armeniáca)/Д.А. Абдуллабекова, А. В. Качалкин//Известия Самарского научного центра РАН. 2012. Т. 14. №1 (8). С. 1864- 1867.
7. Государственный контроль качества винодельческой продукции. — М.: Изд-во стандартов. 2003. 872 с.
8. Абдуллабекова Д.А. Толерантность природных дрожжей Saccharomyces vini к температуре/Д.А. Абдуллабекова//Виноделие и виноградарство. 2007. №5. С. 9.
9. Бурьян, Н.И. Микробиология виноделия/ Н.И. Бурьян. — Симферополь: Таврия. 2002. 403 с.
10. Lindow S.E., Brandl М. Microbiology of the Phyllosphere//Applied and Environmental Microbiology. 2003. V. 69. №4. P. 1875-1883.
11. Чернов И.Ю. Синэкология и география почвенных дрожжей/И.Ю. Чернов: дисс... на соиск. ученой степени докт. биол. наук. М.: МГУ. 2000. 365 с. 

* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-01222 и гранта Отделения биологических наук РАН, программа «Биологические ресурсы России: динамика в условиях глобальных климатических и антропогенных воздействий».