Реидентификация штаммов дрожжей-сахаромицетов из Национальной коллекции микроорганизмов

Н.И. Бурьян, д.т.н., профессор, вед.н.с. отдела микробиологии,
С.А. Кяшковская, д.т.н., профессор, нач. отдела микробиологии,
В.А. Загоруйко, д.т.н., профессор, чл.-кор. НААН, зам. дир. по научной работе (виноделие),
Т.К. Скорикова, с.н.с. отдела микробиологии,
Е.В. Иванова, к.т.н., с.н.с. отдела микробиологии,
Т.В. Черноокова, м.н.с. отдела микробиологии
Национальный институт винограда и вина «Магарач»

РЕИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕКОТОРЫХ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ-САХАРОМИЦЕТОВ ИЗ НАЦИОНАЛЬНОЙ КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ВИНОДЕЛИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА

Представлены результаты реидентификации некоторых промышленно-ценных культур дрожжей из Национальной коллекции микроорганизмов для виноделия (НКМВ) с использованием классических и молекулярных методов анализа. Экспериментально подтверждена видовая принадлежность винных дрожжей, идентифицированных ранее по систематике Кудрявцева как Saccharomyces vini и Saccharomyces oviformis, к виду Saccharomyces cerevisiae.

A number of yeast cultures of enological value maintained in the national collection of microorganisms of the Institute “Magarach” were reidentified by conventional and molecular metods. The wine yeast formerly identified as Saccharomyces vini and Saccharomyces oviformis according to the systematics of Kudriavtsev was assigned to the species Saccharomyces cerevisiae, which was proved experimentally.

Ключевые слова: систематика, дрожжи-сахаромицеты, брожение, сахара, электрофореграммы, полимеразная цепная реакция.

При выборе чистых культур дрожжей для производства того или иного типа вина, как известно, важно знать их видовую принадлежность.
Основное количество дрожжей-сахаромицетов, включенных в состав Национальной коллекции микроорганизмов для виноделия (НКМВ) и предоставляемых предприятиям по их заявкам, идентифицированы по систематике В.И. Кудрявцева [1] как Saccharomyces vini с указанием их синонимов в соответствии с систематикой под редакцией Лоддер [2]. Это связано с тем, что наиболее приемлемой для классификации дрожжей винодельческих производств длительное время в СССР считалась именно эта систематика. В данной систематике одноклеточные грибы рассматриваются автором как достаточно обособленная таксономическая группа аскомицетов, объединенная в самостоятельный порядок Unicellomycetales [3]. В зависимости от наличия и типа полового процесса дрожжи включают в три подотдела высших грибов: аскомицетовых, базидиомицетовых и несовершенных. Разделение дрожжей на семейства и роды проводилось на основании таких признаков, как способ вегетативного размножения, тип полового процесса и форма аскоспор. В ней, что особенно ценно для прикладной микробиологии, кроме морфологических и физиолого-биохимических признаков учитывается также приуроченность видов к определенным условиям обитания и их адаптация к этим условиям. Поэтому выбор систематики по В.И. Кудрявцеву в тот период был вполне оправдан.
Современные представления о таксономии и систематике дрожжей обстоятельно представлены в ряде зарубежных изданий: Лоддер, 1994 г., 1970 г. [2], Крегерван-Риж, 1984 г. [4], Курцман, 1998 г., 2003 г. [5, 6]. Систематика дрожжей рода Saccharomyces неоднократно подвергалась пересмотру на основе различного сочетания морфологических, физиологических и биохимических свойств. Например, винные дрожжи, известные по старой литературе как Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces vini, Saccharomyces oviformis в настоящее время отнесены к S. cerevisiae или S. bayanus. Пивные дрожжи, ранее известные как Saccharomyces carlsbergensis и Saccharomyces uvarum, переименованы в S. cerevisiae или S. pastorianus.
В настоящее время к роду Saccharomyces относятся дрожжи, у которых вегетативная фаза преимущественно диплоидная. Аскоспоры шаровидные или эллипсоидные с гладкой стенкой, от одной до четырех в аске.

Таблица 1
Виды рода Saccharomyces по Курцману |5|

Примечания: «+» - реакция положительная; «-» - реакция отрицательная; «п» - реакция переменная.

Аски устойчивые. Виды дрожжей рода Saccharomyces характеризуются круглыми, овальными или эллиптическими клетками, которые размножаются почкованием. Характерная особенность рода сахаромицетов - это сбраживание гексозных сахаров, однако типы сбраживаемых или ассимилируемых сахаров варьируются в зависимости от вида дрожжей [7].
Широко используемые в науке и практике дрожжи Saccharomyces cerevisiae стали первым эукариотическим организмом, у которого определена полная последовательность нуклеотидов генома [8].
В настоящее время таксономисты пытаются построить такую классификацию, которая бы отражала генетическое родство между видами и родами дрожжей. По результатам секвенирования домена D1/D2 гена 26S рРНК (около 600 п.н.) у типовых культур более чем 600 видов аскомицетовых дрожжей [6] была создана компьютерная база данных, используемая для определения таксономического положения новых штаммов. Согласно некоторым сведениям, после пересмотра таксономии с использованием молекулярной диагностики к роду Saccharomyces будут относиться только виды S. bayanus, S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus, S. pastorianus и, возможно, S. uvarum [9, 10].

Целью данного исследования явилась реидентификация видовой принадлежности некоторых промышленноценных штаммов дрожжей сахаромицетов из коллекции НКМВ согласно современной таксономии.
Для этой цели использовали как классические методы, основанные на способности микроорганизмов к сбраживанию сахаров (табл 1), так и молекулярные геноспецефичные, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Видовыми тест-культурами были следующие штаммы, хранящиеся в НКМВ и любезно предоставленные Наумовым Г.И. (табл. 2).
Сбраживание сахаров осуществляли в трубках Дунбара, как это описано в книге Н.И. Бурьян [10].
Результаты представлены в табл. 3, из которой следует, что, кроме двух штаммов, все отобранные культуры по систематике Курцмана могут быть отнесены к виду Saccharomyces cerevisiae. Что касается двух штаммов, то возникшие трудности в реидентитфикации могут быть связаны с их особым положением в систематике винных дрожжей по Кудрявцеву. Так, штамм Херес 20-С относится по систематике Кудрявцева к малочисленному подвиду Saccharomyces oviformis var cheresiensis. Второй штамм - Новоцимлянская-3, единственный из числа представленных в таблице 3, является представителем вида Saccharomyces uvarum.
В таблице 4 даны синонимы винных дрожжей по современной систематике Курцмана, подтвержденные нами экспериментально.
Таким образом, реидентификация классическим методом видовой принадлежности штаммов дрожжей-сахаромицетов подтвердила паспортные данные о их видовой принадлежности и соответствие синонимам систематике по Курцману для большинства культур.
Для подтверждения видовой принадлежности штаммов дрожжей генетическими методами использовали анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов некодирующих участков рДНК (ПДРФ- анализ). Виды рода Saccharomyces различаются последовательностями внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 рДНК и могут быть дифференцированы на основании анализа длин фрагментов рестрикции этого участка. С помощью праймеров р ITS 1 и р ITS4 можно амплифицировать фрагмент, включающий 5.8S рДНК и спейсеры ITS1 и ITS2 (5.8S-ITS фрагмент).

Таблица 2
Видовые тест-культуры дрожжей рода Saccharomyces

Таблица 3
Реидентификация коллекционных культур дрожжей по способности сбраживать сахара (по Курцману)

Примечание: П - переменное значение; * - видовое определение требует уточнения.

Размер амплифицированных 5.8S-ITS фрагментов стандартен для всех видов рода Saccharomyces и составляет 850 п.н. для спейсера ITS1.
В качестве контроля использовали видовые тестеры S. cerevisiae, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus
Идентификация сахаромицетов состояла их двух стадий:

1. амплификация транскрибируемого спейсера ITS1;
2. рестриктазный анализ амплифицированных фрагментов рДНК сахаромицетов при помощи рестриктазы Нае III.

На рис. представлена электрофореграмма продуктов амплификации транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК (в присутствии специфических праймеров (pITS 1/pITS 4) культур дрожжей, принадлежащих к различным родам, встречающимся в виноделии. Из представленных на фореграмме 13 штаммов восемь принадлежали к роду Saccharomyces, остальные принадлежали к родам Schizocaccharomyces, Candida, Pichia, Hansehula и Brettanomyces.
Все штаммы-сахаромицеты при амплификации транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК (в присутствии специфических праймеров р ITS 1/ р ITS4) дали стандартные для этого рода фрагмент рДНК, равный 850 п.н.

Таблица 4
Видовые названия культур дрожжей по двум систематикам

Все штаммы рабочей коллекции дрожжей-сахаромицетов, в отличие от представителей других родов (Candida, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Shizosaccharomyces), при амплификации транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК в присутствии специфических праймеров р ITS 1/р ITS4 дали стандартные фрагменты, равные 850 п.н., что однозначно подтвердило их принадлежность к роду Saccaromyces.
Таким образом, амплификация транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК (в присутствии специфических праймеров р ITS 1/ р ITS4) может служить родовым тестером при идентификации винодельческих дрожжей при анализе дикой микрофлоры.
Эффективность рестриктазного анализа амплифицированных участков ITS рДНК при видовой идентификации дрожжей вида Saccharomyces. cerevisiae подтверждена наличием для всех анализируемых штаммов четырех рестриктазных фрагментов рДНК, соответствующих 325 п.н., 230 п.н., 170 п.н. и 125 п.н., характерных для вида S. cerevisiae (табл.5).
Таким образом, ПЦР - методы анализа, используемые нами при проведении реидентификации промышленно-ценных культур из коллекции НКМВ, подтвердили видовую принадлежность винных дрожжей видов S.vini и S.oviformys (по систематике Кудрявцева) к виду S.cerevisiae согласно современной систематики Курцмана. Этот метод анализа можно рекомендовать для микробиологичного контроля видовой чистоты процессов брожения на заданной культуре.
Авторы выражают большую благодарность супругам Наумовым за оказанную помощь в освоении использованных нами в данной работе методов ПЦР - анализа.

Рис. Электрофореграмма продуктов амплификации транскрибируемого спейсера ITS1 рДНК: М-мар- кер молекулярной массы; 1- тест-культура 401 (S. cerevisiae); 2-тест-культура 403 (S. bayanus); 3 , 4, 6, 8, 9, 10- дрожжи-сахаромицеты соответственно штаммы Штейнберг; 47-К; Каберне-5; Херес 20-С; Новоцимлянская 3; Ленинградская; 5- дрожжи-шизосахаромицеты штамм КП-1; 7- Candida; 11- Pichia; 12- Hansenula; 13- Brettanomyces.

Таблица 5
Рестриктазный анализ ПЦР- амплифицированных фрагментов некодирующих районов рДНК дрожжей SACCHAROVIYCF.S

1. Бурьян Н.И. Практическая микробиология виноделия / Симферополь: Таврида. 2003. - 560 с.