Жизнеспособность гибридных семян и повышение их всхожести методами биотехнологии

УДК 634.8:581.32:575.222.7.085.23
В.В. Лиховской, к.с.-х.н., нач. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии,
Н.П. Олейников, к.с.-х.н., вед.н.с. отдела селекции, генетики винограда и ампелографии,
И.А. Павлова, к.б.н., ст.н.с. сектора клоновой селекции отдела селекции, генетики винограда и ампелографии
Национальный институт винограда и вина «Магарач»

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ГИБРИДНЫХ СЕМЯН ВИНОГРАДА И ПОВЫШЕНИЕ ИХ ВСХОЖЕСТИ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Представлены результаты исследования всхожести гибридных семян от скрещивания родительских форм различных сроков созревания. Выявлено сильное влияние срока созревания материнской формы на всхожесть семян. Установлена и математически описана зависимость всхожести семян от сроков созревания родительских форм. Показана перспективность использования методов in vitro для повышения всхожести семян от скрещивания материнских форм очень раннего срока созревания.

Ключевые слова: сорт винограда, гибридные семена, родительские формы, комбинация скрещивания всхожесть семян, срок созревания, методы in vitro.

Одним из главных направлений селекции винограда, в основе которого лежит всестороннее изучение и использование знаний о структуре генома и генетических закономерностей, является выведение сортов, обладающих высокой продуктивностью и качеством урожая, в сочетании с групповой устойчивостью к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам среды. В настоящее время приоритетным направлением является выведение новых сортов столового направления использования раннего срока созревания, отвечающих экологическим и социальным требованиям. Рациональное внедрение новых сортов сверхранних и ранних сроков созревания позволит усовершенствовать существующий конвейер столовых сортов и увеличить сроки потребления свежего винограда до 3,5 месяцев [1].
Выведение столовых сортов винограда сверхраннего и раннего сроков созревания с крупной ягодой и гроздью, групповой устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам предполагает научно обоснованный подбор исходного материала с учетом его эколого-географического происхождения, а также использование закономерностей наследования селектируемых признаков гибридным потомством [2]. Вопросами изучения раннеспелости долгое время занимались известные селекционеры-генетики: П.Я. Голодрига, Ю.А. Мальчиков, С.С. Хачатрян, С.А. Погосян, М.С. Журавель, Н.И. Гузун, Е.Н. Докучаева, Л.Ф. Мелешко, Н.А. Дудник и многие другие [3]. Создание сорта включает ряд последовательных этапов: генеративную гибридизацию, выращивание сеянцев и выделение в элиту по совокупности хозяйственно ценных признаков трансгрессивных рекомбинантов, ускоренное их размножение, создание маточных насаждений, проведение сортоиспытания. На этапе выращивания сеянцев действует ключевой фактор - всхожесть гибридных семян, который напрямую определяет результативность гибридизации в целом.

Целью работы являлось установление закономерностей влияния срока созревания материнских и отцовских форм на всхожесть гибридных семян, сортовой специфичности родительских компонентов, прогнозирование всхожести семян, а также ее повышение методами биотехнологии.

Предметом исследований являлась всхожесть более 35 тыс. гибридных семян от скрещивания 17 материнских и 21 отцовской исходных форм, созданных учеными НИВиВ «Магарач», ННЦ «ИВиВ им. Е.В. Таирова», Всеросс. НИИВиВ им. Я.И. Потапенко, Национального ИВиВ Молдовы, приватными и зарубежными селекционерами.
Исследования проводились в период 20052013 гг. в полевых условиях на селекционном участке в Донецкой области вблизи г. Мариуполь, в гидропонных каналах ОПБ «Магарач» (пос. Отрадное) и почвенных каналах ГПОХ «Приморское» (пос. Партенит).
На практике при моделировании различных процессов, в частности биологических, широко используют те или иные способы вычисления приближенных значений функций по известным значениям в некоторых фиксированных точках. Такие задачи приближения функций часто возникают при построении формул для вычисления значений характерных величин исследуемого процесса по экспериментальным табличным данным, при вычислении значений функций в промежуточных точках рассматриваемого интервала и при определении значений за пределами интервала, в частности при прогнозировании. С помощью регрессионного анализа можно продолжить линию тренда на диаграмме и оценить значения, которые находятся за пределами фактических данных, степень связи между переменными и провести вычисления предполагаемого значения переменной на основе нескольких уже известных значений.
Если для моделирования некоторого процесса, заданного таблицей, построить функцию, приближенно описывающую данный процесс методом наименьших квадратов, то она будет называться аппроксимирующей функцией (регрессией), а сама задача построения аппроксимирующей функции - задачей аппроксимации. Пакет MS Excel решает задачи построения (создания) регрессий для таблично заданных функций, что и является основой регрессионного анализа. На основе данных, диаграмма Excel позволяет получать линейный, полиномиальный, логарифмический, степенной, экспоненциальный типы регрессий, которые описываются уравнением: Y=F(x), где F(x) - аппроксимирующая функция, а x - независимая переменная, которая принимает значения последовательности натурального ряда чисел (1; 2; 3; ...).
Линия тренда предназначена для графического отображения аппроксимирующей функции, показывающей направление изменения экспериментального ряда данных, и помогает решить общие задачи прогноза. Наиболее точная аппроксимация попеременно возрастающих и убывающих экспериментальных данных описывается полиномиальной линией тренда. При подборе линии тренда Excel автоматически рассчитывает значение величины R2, которая характеризует достоверность аппроксимации: чем ближе значение R2 к единице, тем надежнее линия тренда аппроксимирует исследуемый процесс. 

Таблица 1
Жизнеспособность гибридных семян от скрещивания материнских форм, 2005-2012 гг.

Величина достоверности аппроксимации R2 (квадрат смешанной корреляции) рассчитывается по формуле:
Анализ экспериментального материала позволил произвести группировку исходных форм и оценить их влияние на всхожесть семян. Были сформированы комплексы, в которых в качестве материнских и отцовских включены сорта с очень ранним, ранним, средним, поздним и очень поздним сроками созревания.
В табл. 1 приведены показатели жизнеспособности гибридных семян от скрещивания материнских форм, а на рис. 1 показано влияние материнских форм разного срока созревания на всхожесть гибридных семян. При вовлечении в гибридизацию материнских форм всхожесть семян варьировала от 0 для форм очень раннего срока созревания (Юбилей херсонского дачника, Прометей, Гурман ранний, София) до 39% для позднего сорта Катта Курган. Средняя всхожесть семян от скрещивания материнских форм составила 21,8%. О сильном влиянии срока созревания материнских форм на всхожесть семян свидетельствует высокое значение коэффициента линейной корреляции Пирсона равное 0,91.


Согласно шкале МОВВ материнские формы сгруппированы по срокам созревания, где 1 - очень ранний, 3 - ранний, 5 - средний, 7 - поздний срок созревания. В группу сортов очень раннего срока созревания вошли элитные формы Юбилей херсонского дачника, Прометей, Гурман ранний, София. Оценено 25 комбинаций скрещивания. Наибольшее количество семян - 559 шт., получено в результате использования в качестве материнской формы София, наименьшее - 199 семян - от элитной формы Гурман ранний. Методом флотации оценена полноценность семян. Из полученных в результате гибридизации 524 семян от формы Юбилей херсонского дачника всего 12% имели вполне выполненный эндосперм. Наибольшее количество выполненных семян - 476 шт. (79,5%), обеспечила форма София. Из посеянных 1539 шт. выполненных семян от скрещивания материнских форм очень раннего срока созревания не получено ни одного сеянца. Таким образом, при вовлечении в гибридизацию материнских форм очень раннего срока созревания вероятность получения полноценных гибридных сеянцев приближается к нулю.
В качестве сорта раннего срока созревания в гибридизацию вовлекалась материнская исходная форма Флора. Изучено 30 комбинаций скрещивания в объеме 3062 семян. Выход выполненных семян составил 60,5%. Из высеянных 1853 семян получено 119 сеянцев, т.е. всхожесть семян в среднем составила 6,4%.
Сорта среднего срока созревания представлены 7 материнскими формами: Мускат Джим, Талисман, Подарок Украине, Восторг красный, Чауш, Деметра и Атлант запорожский. В изучении находилось 99 комбинаций скрещивания. Получено 9867 семян, из которых наибольшее количество (4527 семян) обеспечил сорт Мускат Джим, хотя наибольшее количество - 48 комбинаций скрещиваний, было выполнено с сортом Талисман. Минимальный процент выполненных семян (49,9%) отмечен у исходной формы Подарок Украине, а максимальный (96,0%) - у формы Деметра. Всхожесть семян у группы сортов среднего срока созревания варьировала от 10,3% у формы Мускат Джим до 30,8% - у формы Атлант запорожский. Наименьшее количество сеянцев (10 шт.) выращено в популяциях, где в качестве материнской формы использовался сорт Восторг красный, что не позволяет выполнить гибридологический анализ. Средняя всхожесть семян для сорта Восторг красный составляет 17,2% и для гарантированного получения элитных форм необходимо увеличить количество семян до 250-400 шт.
Несмотря на то, что в исследование включено только 5 форм позднего срока созревания (Фламинго, Подарок Запорожью, Магарач №31-77-10, Нимранг, Катта-Курган), в 78 комбинациях скрещивания с участием этих форм получено 11658 семян. Процент выполненных семян сортов в этой группе варьировал от 87,1% у сорта Фламинго до 95,3% - у Магарач №31-77-10. Всхожесть семян у сорта Фламинго (26,4%) была несколько ниже, чем у сортов среднего срока созревания - Деметра (28,3%) и Атлант запорожский (30,8%). Остальные поздние сорта, в сравнении с сортами других групп, формировали достаточно жизнеспособные гибридные семена. Наиболее высокая всхожесть семян - 39,1%, характерна для сорта Катта-Курган.


Рис.1. Всхожесть гибридных семян от скрещивания материнских форм различного срока созревания: 1 - Юбилей херсонского дачника; 2 - Прометей; 3 - Гурман ранний; 4 - София; 5 - Флора; 6 - Мускат Джим; 7 - Талисман; 8 - Подарок Украине; 9 - Восторг красный; 10 - Чауш; 11 - Деметра; 12 - Атлант запорожский; 13 - Фламинго; 14 - Подарок Запорожью; 15 - Магарач №31-77-10; 16 - Нимранг; 17 - Катта Курган.

Рис. 2. Влияние срока созревания материнских форм на всхожесть гибридных семян

В табл. 2 представлены показатели жизнеспособности гибридных семян от скрещиваний с отцовскими формами. Отцовские, как и материнские формы, сгруппированы по срокам созревания. Раннеспелость отцовских форм, по сравнению с материнскими, оказывает более слабое влияние (коэффициент корреляции равен 0,33) на всхожесть гибридных семян (рис.2). Средняя всхожесть семян от скрещивания отцовских компонентов составила 29,9%. Тем не менее, прослеживается тенденция повышения всхожести семян при вовлечении в гибридизацию отцовских форм среднего срока созревания. Наибольшая всхожесть семян (более 40%) отмечена в комбинациях скрещивания с участием сортов среднего срока созревания: Атаман, Ялтинский бессемянный и Жасминовый Магарача.
Анализ группы сортов очень раннего срока созревания показывает, что из 6 отцовских форм (Ромулус, Ришелье, Кардинал, Русбол улучшенный, Сверхранний бессемянный Магарача и Первозванный) нулевую всхожесть семян имели комбинации, где в качестве отцовской формы использовался сорт Ромулус, а и наиболее высокую всхожесть (39,7%) - скрещивания с сортом Первозванный. Группа ранних сортов представлена тремя формами - Розовый Тимур, Ливия, Аркадия. Проанализирована всхожесть 1349 семян. Всхожесть семян в скрещиваниях с участием сорта Розовый Тимур составила 25,3%, Ливия - 32,3%, Аркадия 37,6%. В группу из 5 сортов среднего срока созревания вошли Кишмиш черный, Кишмиш лучистый, Атаман, Ялтинский бессемянный, Жасминовый Магарача. Всхожесть семян варьировала от 24,7% у сорта Кишмиш черный до 50,3% - у сорта Жасминовый Магарача.
Наибольшее количество семян - 4026, изучено там, где в гибридизации участвовали сорта позднего срока созревания - Геркулес, Красень, Ред глоуб, Кишмиш молдавский, Мускат гамбургский, Италия. Всхожесть семян в этой группе варьировала от 21,7 до 32,9%. Минимальная средняя всхожесть семян в этой группе составила 28,7% для сорта Ред Глоуб, а максимальная - 31,8% -для сорта Кишмиш молдавский. От скрещиваний очень позднего сорта Памяти Голодриги проанализировано 643 гибридных семени, где этот сорт выступал в качестве отцовской формы. Процент выполненных семян составил 96,6, а их всхожесть - 24,5%.
На рис. 2 и 4 показано влияние срока созревания материнских и отцовских компонентов на всхожесть гибридных семян. Известно, что степень аппроксимирующего полинома определяется количеством экстремумов (максимумов и минимумов) кривой, т.е. полиномом второй степени можно описать только один максимум или минимум. Аппроксимация полиномом второй степени хорошо подходит как для материнских, так и для отцовских форм. На диаграммы (рис. 2 и 4), построенные на основе экспериментальных данных, наложены полиномиальные линии тренда второй степени, которые описывают зависимость всхожести гибридных семян от сроков созревания родительских компонентов. Близкие к единице величины достоверности аппроксимации для материнских и отцовских форм (0,988 и 0,875 соответственно) свидетельствуют о хорошем совпадении кривых с экспериментальными данными. Таким образом, прогноз всхожести гибридных семян можно осуществлять по следующим формулам:
- для материнских форм;
- для отцовских форм,
где Y - всхожесть семян в процентах; x - индекс группы раннеспелости родительских форм (1 - очень ранние, 2 - ранние, 3 - средние, 4 - поздние, 5 - очень поздние).

Таблица 2
Жизнеспособность гибридных семян от скрещивания отцовских форм, 2005-2012 гг.

Рис.3. Всхожесть гибридных семян от скрещивания отцовских форм различного срока созревания: 1 - Ромулус; 2 - Ришелье; 3 - Кардинал; 4 - Русбол улучшенный; 5 - Сверхранний б/с Магарача; 6 - Первозванный; 7 - Розовый Тимур; 8 - Ливия; 9 - Аркадия; 10 - Кишмиш черный; 11 - Кишмиш лучистый; 12 - Атаман; 13 - Ялтинский бессемянный; 14 - Жасминовый Магарача; 15 - Геркулес; 16 - Красень; 17 - Ред глоуб; 18 - Кишмиш молдавский; 19 - Мускат гамбургский; 20 - Италия; 21 - Памяти Голодриги.

В селекции винограда, направленной на создание высококачественных сортов винограда очень раннего срока созревания, в качестве материнских форм предпочтительно использовать ранние столовые сорта. С другой стороны, гибридные семена от таких скрещиваний имеют практически нулевую всхожесть из-за недоразвития эндосперма и в обычных условиях прорастают единичные экземпляры. Использование методов invitro для культивирования семян винограда позволяет создать оптимальные условия для их прорастания, роста и развития растений, тем самым, преодолев низкую всхожесть семян, получить жизнеспособное потомство [4, 5].
Материалом для исследования служили семена, полученные в результате гибридизации сорта

Флора с различными опылителями (Новый Подарок, Ришелье, Сверхранний Элегант, Кодрянка, Кардинал, Находка Мариуполя) на участке в г. Мариуполь.

Таблица 3
Прорастание семян винограда в условиях invitro, в зависимости от этапа сбора

С целью определения оптимальной даты сбора материала, ягоды срезали в три этапа: I этап - в начале размягчения, II - в начале созревания и III - в период физиологической зрелости. Стерилизацию семян осуществляли этиловым спиртом в течение 40 сек., а затем 8 мин. 0,1%-ным диоцидом с последующей 3-кратной промывкой автоклавированной дистиллированной водой на протяжении 10 мин. В условиях ламинарного бокса после стерилизации и механической манипуляции по отсеканию халазальной части фрагмент семени с предполагаемым зародышем вводили в культуру. Культивирование проводили в темноте при температуре +20-25°С. Для культивирования использовали только выполненные семена, содержащие эндосперм. Наличие эндосперма в семенах определяли визуально. Пустые семена отбраковывались. Культивирование семян проводили в темноте на модифицированной среде NN (1969), содержащей БАП в концентрации 0,5 мг/л [6].
По мере прорастания семян проводили дальнейшие операции. Для последующего роста и развития проростков в стерильных условиях их пересаживали в стаканчики объемом 150 мл на среду Н, содержащую БАП в концентрации 0,2-0,4 мг/л [7, 8].
Культивирование проростков, растений осуществлялось на свету интенсивностью 1500 люкс при 16-часовом фотопериоде и температуре +27°С.
Когда побеги у растений достигали 4-5 междоузлий, их в стерильных условиях расчеренковывали на 1-2-глазковые экспланты и высаживали на среду Н [7, 8] с добавлением гумата Na (30 мг/л). Культивирование проводили как на безгормональной среде, так и с добавлением НУК в концентрации 0,1 мг/л. Через 30-35дней вырастали растения с хорошо развитой корневой системой. Адаптацию растений к условиям invivo и доращивание проводили в условиях гидропонной культуры на гравийном субстрате.
После высадки семян в условия invitro каждые пять дней проводили наблюдения за всхожестью семян, развитием растений. Первые проростки были зафиксированы через несколько месяцев после начала культивирования семян (рис.5). Период прорастания в среднем занял около шести месяцев. Семена, изолированные и высаженные на питательную среду на разных этапах созревания ягоды, прорастали с неодинаковой частотой. Семена, изолированные в начале размягчения ягоды, имели более длинный период прорастания. Семена, выделенные в период физиологической зрелости ягоды, труднее вводились в условия invitro, наблюдалось инфицирование материала, увеличивалась доля пустых семян. Особенно в популяции Флора х Ришелье было отмечено значительное число пустых семян в этот период.

Срок созревания отцовской формы
Рис. 4. Влияние срока созревания отцовских форм на всхожесть гибридных семян

Рис. 5. Прорастание семян винограда в популяции Флора х Новый Подарок Запорожью

Таким образом, наиболее оптимальным для отбора материала является второй этап - период начала созревания ягоды (табл. 3). В популяции Флора х Кардинал 50% проростков было получено из семян, изолированных именно в этот период. Для остальных популяций основная масса проростков была получена после обновления среза семени в халазальной части и последующей пересадки на свежую питательную среду.

В различных популяциях прорастание семян варьировало от 8,9% (Флора х Ришелье) до 49,9% (Флора х Сверхранний Элегант) (табл.4). Отмечено, что значительная часть проростков развилась в растения в результате непосредственного роста осевых органов. В единичных случаях были зафиксированы отклонения от нормального развития, различные аномалии семядольных листьев, подсемядольного колена, каллусообразование, формирование множественных побегов, что типично для проростков, развивающихся в условиях invitro [9]. Растения развивались с крепким побегом, относительно крупной листовой пластинкой и мощной корневой системой (рис.6). Получено 114 растений, что составило 71,1% от числа проростков. С целью сохранения, полученных гибридных форм, растения тиражировали микрочеренкованием, затем высаживали на адаптацию в гидропонную теплицу. Адаптировано 50 гибридных форм и выращены полно - ценные саженцы, приживаемость которых в полевых условиях составила около 100%. В результате селекционного отбора по совокупности хозяйственно значимых признаков выделено элиту - 7 гибридных форм. Исследования, проведенные на ЮБК, позволили в популяции Флора х Находка Мариуполя выделить в суперэлиту гибридную форму Магарач №ЛНМ-16 и заявить ее как будущий столовый сорт раннего срока созревания (рис. 7). В 2013 г. подана заявка на экспертизу сорта Сонячне гроно (Магарач №ЛНМ-16) для регистрации в Государственном Реестре сортов растений, пригодных для распространения в Украине.

Выводы.

На основе изучения всхожести более 35 тыс. семян оценены показатели жизнеспособности семян от скрещивания различных по срокам созревания 17 материнских и 21 отцовской форм.
Установлена прямая сильная взаимосвязь срока созревания материнских форм и всхожести семян (коэффициент линейной корреляции Пирсона равен 0,91). Выход сеянцев варьировал от нуля в скрещиваниях очень ранних материнских форм до 39% - в скрещиваниях поздних материнских форм. Прослеживается тенденция повышения всхожести семян при вовлечении в гибридизацию отцовских форм среднего срока созревания.
Экспериментальные данные по влиянию срока созревания материнских и отцовских форм на всхожесть гибридных семян аппроксимированы полиномиальными уравнениями второй степени, которые позволяют прогнозировать выход жизнеспособных сеянцев
-     для материнских форм;
-    для отцовских форм.
Близкие к единице величины показателя достоверности аппроксимации R2 для материнских (0,988) и отцовских (0,875) форм свидетельствуют о хорошем совпадении кривых с экспериментальными данными.
Применение методов invitro позволяет повысить всхожесть семян от гибридизации ранних сортов винограда от нуля до 49,9% и получить жизнеспособное потомство.
Впервые на территории Украины из культуры invitro получено 7 элитных форм, из которых выделен сорт столового винограда Сонячне гроно раннего срока созревания.

Рис. 6. Растения винограда популяции Флора х Находка Мариуполя
Рис. 7. Плодоношение сорта Сонячне гроно (Флора х Находка Мариуполя)

Таблица 4
Прорастание семян и выход растений винограда в условиях invitro