Ю.С. Лысак, А.И. Присталов, Т.Ф. Стрибуль, А.Т. Ходько,
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, 61015, г. Харьков, ул. Переяславская, 23, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЕ КОНСЕРВИРОВАНИЕ МЕРИСТЕМ ВИНОГРАДА
Разрабатываются методы быстрого замораживания меристем винограда на основе витрифицирующих криопротекторных смесей. Исследуется действие различных криопротекторов и их композиций на меристемы винограда на разных этапах криоконсервирования.
Ключевые слова: меристема, виноград, криоконсервирование, криопротектор, витрификация, культивирование.
The methods for rapid freezing of grape meristems based on vitrification cryoprotective mixtures are developed. The effect of different cryoprotective and their compositions to the meristems of grape at different stages of cryopreservation is investigated.
С целью сохранения генетических ресурсов растений в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАНУ проводятся эксперименты по криоконсервированию меристем винограда. Процесс криоконсервирования включает подготовку исходного материала (выделение меристем из растений, выращенных in vitro), насыщение их криопротекторами, помещение меристем в контейнеры, замораживание по определенным режимам до температуры жидкого азота, хранение материала в низкотемпературном хранилище в течение некоторого времени [1]. По окончании срока хранения меристемы подвергают отогреву до комнатной температуры, отмывают их от криопротекторов и культивируют с целью определения сохранности меристем после криоконсервирования.
Цель работы.
Целью настоящей работы явилось исследование действия криопротекторов полимерной природы и их смесей на меристемы винограда в процессе низкотемпературного консервирования.
Материалы и методы.
Меристемы выделяли из растений винограда сорта Изабелла, выращенных in vitro. После выделения меристемы культивировали в течение 24 ч на среде Murashige and Skoog (MS) с половинным составом солей (1/2 MS), затем их помещали в растворы криопротекторов, приготовленные на той же среде.
Исследовали следующие криопротекторы:
- 1М раствор 1,2-пропандиола (1,2-ПД) на среде 1/2 MS;
- 7%-й раствор поливинилпирролидона (ПВП) с молекулярной массой 24000 на среде 1/2 MS;
- раствор 1,2-ПД в концентрации 1М и ПВП в концентрации 3,5% на среде 1/2 MS;
- раствор 1,2-ПД в концентрации 1М и ПВП в концентрации 7% на среде 1/2 MS;
- раствор этиленгликоля (ЭГ) в концентрации 1М и ПВП в концентрации 3,5% на среде 1/2 MS.
Выбор состава криопротекторных смесей был обусловлен предварительным изучением оценки их токсического действия на меристемы винограда с помощью флуоресцентного метода с использованием конфокальной микроскопии [3].
Меристемы помещали в растворы криопротекторов на 30 мин. для насыщения. Затем, в стерильных условиях меристемы запаивали в пленочные тонкостенные контейнеры, изготовленные на основе фторопласта. Замораживание контейнеров с меристемами осуществляли путем прямого погружения их в жидкий азот (быстрое замораживание) [2].
Отогрев проводили в водяной бане с температурой +35°С.
После отогрева меристемы отмывали от криопротекторов путем 2-кратной смены среды 1/2 MS в течение 40 мин. [5].
В течение последующих 24 ч меристемы находились на среде 1/2 MS в темноте, затем их переносили в фитоторон для дальнейшего культивирования.
Сохранность меристем винограда оценивали на 5-й день культивирования путем подсчета количества живых меристем к общему их количеству. Живыми считались меристемы, проявляющие тенденцию к росту и приобретающие зеленую окраску [4].
Каждая экспериментальная группа насчитывала 5-7 меристем. Эксперимент проводился трехкратно.
Для оценки достоверности различий экспериментальных данных применяли критерий Стьюдента.
Сохранность меристем винограда после замораживания до -196С, %
Таблица
*различия достоверны по сравнению с контролем, Р<0,05
Результаты и обсуждение.
Из исследованных криопротекторов - чистых веществ (1,2 ПД и ПВП) более эффективным и менее токсичным оказался 1,2 ПД, что отразилось на сохранности меристем винограда после размораживания (табл.) [4].
При использовании смесей криопротекторов более эффективной оказалась композиция 1М раствора 1,2 ПД и 7% раствора ПВП (табл.). Кроме того, что эта смесь обладала хорошим криозащитным действием, она не оказывала негативного влияния на физиологические процессы: развитие меристем не угнеталось, а, наоборот, стимулировались процессы роста и развития.
Выводы. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что использование исследуемых смесей криопротекторов полимерной природы оказалось более эффективным, по сравнению с отдельными криопротекторами в отношении сохранности меристем винограда после размораживания.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Бурутин А.Б., Бутенко Р.Г., Катаева Н.В., Голодрига П.Я. Долгосрочное культивирование винограда// Сельскохозяйственная биология - 1983 -№7. - С.48-50.
- Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А. Сверхбыстрые скорости и витрифицирующие растворы в криобиологии // Проблемы криобиологии. 1994. №2. С.29-37.
- Стрибуль Т.Ф Лысак Ю.С., Компаниец А.М.
- Изменение интенсивности флюоресценции клеток меристемной ткани винограда под действием ряда криопротекторов // Проблемы криобиологии. 2010. - №3. - С.297-302.
- Шевченко Н.А., Стрибуль Т.Ф., Розанов Л.Ф. Действие многоатомных спиртов, амидов и ДМСО на сохранность меристем винограда и картофеля // Проблемы криобиологии. - 2004.-№ 3.-С. 79-85.
- Matsumoto Т., Sakai A. Cryopreservation of grape in vitro-cultured axillary shoot-tips by three-step vitrification// Cryopreservation of tropical plant germplasm. — 2000. — P. 424-425.
