Молекулярные аспекты оценки сортов и диких форм винограда и сохранение их в условиях in vitro

УДК 634.84:577.21:57.085.2

В.П. Рисованная, С.М. Гориславец,
Лаборатория молекулярно-генетических исследовании Национального института винограда и вина «Магарач». Украина, г. Ялта;

Roberto Bacilieri
Institut national de la recherche agronomique. Centre INRA de Montpellier 2 Place Viala, 34000 Montpellier. France

Образцы селекционных сортов и диких форм проанализированы методом SSR-ПЦР анализа с целью идентификации, паспортизации и оценки происхождения. По полиморфным молекулярным маркерам оценена стабильность генотипов при длительном культивировании в коллекции in vitro.

На первом рабочем совещании по проекту ЕС GrapeGen06 был представлен рабочий пакет по созданию длительной стратегии рационального использования генофонда винограда, обмена и хранения его в масштабах национальных и европейских уровней. Основой для решения этих проблем является идентификация и анализ генетических ресурсов винограда [1].

В настоящее время с этой целью в мире широко применяются молекулярные методы анализа, позволяющие более точно дифференцировать генотипы. Одним из наиболее информативных методов изучения генетического разнообразия растений на молекулярном уровне считается метод анализа ДНК с использованием микросателлитных маркеров. Вследствие своей кодоминантности. высокой информативности и простоты оценки микросателлиты являются идеальными молекулярными маркерами для генотипирования сортов [2]. Применение этого метода для изучения винограда, в дополнение к его ампелографическим характеристикам, позволяет более точно идентифицировать сорта, оценивать их происхождение и дифференциацию, реконструировать родословную, выявлять синонимы и примеси на коллекции [3]. В предлагаемой статье представлены примеры изучения культурных и диких форм винограда по молекулярным маркерам.

Исследования проводились в рамках международного проекта ECO-NET «Генетические ресурсы культурного и дикого винограда: идентификация, описание, оценка и использование старых сортов и диких генотипов» на базе Института сельскохозяйственных исследований (INRA, Montpellier, Франция).

Материалы и методы  Растительный материал.

В качестве материала для исследований использованы образцы сортов культурного винограда (селекционные, аборигенные) и дикие формы рода Vitis L. Амплификация экстрагированной ДНК винограда была выполнена в реакционной смеси с использованием микросателлитных праймеров, рекомендованных Европейской базой данных и проектом GrapeGen06, с помощью ПЦР-анализа. Генотипирование сортов проводилось по 6-22 микросателлитным профилям ядерной ДНК (пДНК) и 3 хлоропластной (срДНК) на базе 1NRA на автоматическом секвенаторе АВ1 Prism 3130XL (Applied Biosystems). Для оценки результатов секвенирования использовали программу Gene Map 3.5.

Результаты и обсуждения

Оценка наследования и/или происхождения гибридных сортов и форм винограда является одной из важных задач селекционного процесса. Для анализа отношений родитель - потомок были отобраны селекционные сорта технического направления использования: Рубиновый Магарача, Рубин Голодриги, Антей магарачский и Гранатовый Магарача, характеризующиеся групповой устойчивостью к болезням и вредителям, а также их родительские формы (рис.1). Эти сорта имеют межвидовое происхождение, поскольку среди их родительских форм, кроме сортов Каберне-Совиньон и Саперави, на разных этапах селекционного процесса были использованы сложные межвидовые гибриды, такие как Сейв Виллар 20347, Магарач 6-68-27, Магарач 85-64-16 и др. На первом этапе анализ, проведенный по 6 микросателитным локусам: VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, ssr VrZAG62 и ssr VrZAG79, подтвердил отношение родитель - потомок для сорта Рубиновый Магарача. Однако этого количества локусов оказалось недостаточно для оценки отношения у других сортов, которые являются близкими по происхождению.

Рис.1. Схема скрещивания, в результате которой были получены селекционные сорта. Жирным шрифтом выделены сорта, которые были включены в эксперимент, остальные родительские формы отсутствуют

Поэтому спектр микросателлитных локусов в целом был увеличен до 22-х ядерных и 3-х хлоропластных. Особенность хлоропластных гаплотипов заключается в том, что они наследуются по материнской линии. Это позволило установить, что сорта Антей магарачский и Рубин Голодриги наследуют гаплотип D (107/104/115) и 50 % аллелей микросателлитных локусов от материнского сорта Рубиновый Магарача. Отцовские формы Магарач 85-64-16 и Магарач 6-68-27 отсутствуют, при этом общая доля аллелей микросателлитных локусов в генотипах сорта Антей магарачский и Сейв Виллар 20347 составляет 50 % (табл. 1).

Таблица 1
Пример микросателлитных профилей пДНК селекционных сортов и их родителей.
Размеры ПЦР-фрагментов указаны в парах нуклиотидов

Таким образом, вопрос об отцовской форме сорта Антей магарачский требует дальнейшего изучения. Сорт Рубиновый Магарача наследует гаплотип D от своего материнского сорта Каберне-Совиньон. Генотип сорта Гранатовый Магарача несёт 50 % общих аллелей с отцовским сортом. Два его образца, имеющиеся на коллекции, проанализированы по локусам: VVIb 01, Win 16, WMD24, WMD32, WMD5, ZAG62 и ZAG79. Было установлено, что генотипы этих образцов имеют в каждом локусе одну общую аллель в т.ч. и с отцовским сортом Антей магарачский. Наличие общего аллеля в каждом локусе свидетельствует о родственных отношениях этих образцов. Вероятно, они были получены вследствие вегетативного размножения двух разных сеянцев от одного скрещивания. Это согласуется с результатами анализа образцов по хлоропластным локусам ССМРЗ, ССМР5, ССМР10. Оба образца сорта Гранатового Магарача имели одинаковый гаплотип А (106/105/114), что возможно при наличии общей материнской формы.

Молекулярио-генетические паспорта или коды сортов винограда. На основе микросателлитных профилей получены уникальные «молекулярно-генетические паспорта» или коды сортов, примеры которых представлены в табл. 2; идентифицированы некоторые синонимы; создана база генетических профилей сортов винограда (база генетического сходства/различия).

Таблица 2
Коды сортов по микросателлитным локусам в соответствии с требованиями Европейской базы данных винограда

Стабильность генотипов винограда в разных экологических зонах и при длительном культивировании в условиях in vitro. Оценкой стабильности и стандартизацией результатов молекулярно-генетического профилирования сортов винограда занимается ряд европейских лабораторий, в том числе и в рамках проекта GrapeGen06. Нами были проанализированы по 22 ядерным микросателлитным локусам образцы некоторых сортов винограда, сохраняющиеся на ампелографической коллекции НИВиВ «Магарач» и коллекции Вассал (Франция). Сравнительный анализ полученных микросателлитных профилей установил, что, например, генотипы образцов Каберне-Совиньон и Кишмиш чёрный идентичны.

В связи с угрозой сокращения генетического разнообразия ресурсов винограда большое значение имеет размножение, сохранение и, следовательно, длительное культивирование ценных генотипов в условиях in vitro. Современные технологии получения посадочного материала винограда методами in vitro предполагают контроль стабильности генома при длительном культивировании. Образцы сортов Гранатовый Магарача, Рубин Голодриги, Рубиновый Магарача и Антей магарачский поддерживаются микрочеренкованием в коллекции in vitro более 10 лет.
Сравнительный анализ генотипов этих образцов и исходных сортов, растущих на коллекции, был проведен по микросателлитным локусам: VVlnl6, VVIp60, VVIv67, VVMD21,VVMD27,VVMD28. Полученные результаты показали стабильность их аллельного состава независимо от длительности культивирования.
Изучение генома дикого винограда актуально как для селекции, так и для решения вопросов происхождения культурного винограда. В настоящее время в горных заповедных зонах Крыма еще существуют очаги естественного произрастания дикого винограда. Образцы, обнаруженные в долине реки Учан-Су (Алушта), а также в районе «большой Ялты», были проанализированы методом SSR-ПЦР по 20 микросателлитным локусам. Полученные результаты анализируются.

Источник: Мобилизация и сохранение генетических ресурсов винограда, совершенствование методов селекционного процесса: сборник научных статей / ГНУ Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии. - Новочеркасск: Издательство ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, 2008.

Литература:
1. Patrice This. Minutes of the First GrapeGen06 Workshop March 2nd and 23rd, 2007 Presidence's building 1NRA, Versailles (France). 15pp.
2. Sefc KM, Lefort F, Grando MS, Scott K, Steinkellner H and Thomas MR. Microsatellite markers for grapevine: a state of the art, 433-463. In: Molecular biology and biotechnology of grapevine. Kluvver Publishers. Amsterdam.- 2001 .-499 p.
3. Lefort F.. Gorislavets S., Risovannaya V., Troshin L. Genetic Profiling Of Moldavian, Crimean and Russian Cultivars of Vitis vinifera L. with nuclear microsatellite markers // Oenologie. - Paris: Editions Tec & Doc, 2003. - P. 71-73 iz 694 p.

Источник: Мобилизация и сохранение генетических ресурсов винограда, совершенствование методов селекционного процесса: сборник научных статей / ГНУ Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им. Я.И. Потапенко Россельхозакадемии. - Новочеркасск: Издательнство ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко, 2008.