УДК 634.8:581.142/192.7:631.524.821
В.А. Зленко, к.с.-х.н.. с.н.с. отдела селекции. генетики винограда и ампелографии Национальный институт винограда и вина «Магарач»

ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПРОРАСТАНИЕ СЕМЯН ВИНОГРАДА И ОТБОР СЕЯНЦЕВ ПО ПРИЗНАКАМ СИЛЫ РОСТА И ВЫЗРЕВАНИЯ ЛОЗЫ

Разрабатываются селективные системы отбора на уровне семян — ускорения или замедления их прорастания после обработки растворами биологически активных веществ. Наибольшей силой роста побегов обладали сеянцы. выросшие из семян. взошедших первыми после обработки раствором с добавлением Д.L-триптофана (100 мг/л); а лучшее вызревание лозы было у сеянцев. развившихся из семян, обработанных раствором с добавлением β-индолилуксусной кислоты (ИУК) (5 мг/л). a-нафтилуксусной кислоты (НУК) (1 мг/л) и Nб-бензиладенина (БА) (1 мг/л), а также Са(ОН)2 (1000 мг/л).

Ключевые слова: виноград, селекция на уровне семян, селективные системы отбора, биологически активные вещества, вымачивание семян, прорастание семян, сила роста побегов, вызревание лозы.

Введение.

До широкого применения методов генной инженерии для создания трансгенных форм растений, в 70-90-е годы прошлого столетия проводились исследования по созданию селективных систем отбора на клеточном уровне invitro у различных сельскохозяйственных культур [1, 2]. Для винограда достигнуты успехи по отбору в жидких средах invitro клеток, устойчивых к NaCl [3], к холоду [4] и к CaCO3 (селекция на устойчивость к активной извести в почве) [5]. Получены устойчивые к Elsinoe ampelina растения-регенеранты винограда путем внесения культурального фильтрата этого патогена в суспензии клеток и соматических эмбриоидов [6].
Так как трансгенные растения нарушают экологические системы и представляют опасность для здоровья людей и животных, все-таки может быть оправдано возвращение к селекции на уровне клеток, соматических эмбриоидов [7-10], зиготических зародышей и целых семян на стадии их прорастания; а также к традиционной селекции путем скрещивания, без привнесения чужеродных генов и систем их переноса.
В результате скрещивания, когда один из родителей с женским типом цветка или когда осуществляют инцухт у генотипов с большой гетерозиготностью, получают большое количество семян. Для селекционеров могут представлять интерес семена, которые остаются после виноделия из урожая сортов, устойчивых к биотическим и абиотическим факторам внешней среды, таких как Тавквери Магарача, Кентавр магарачский, Данко, Первенец Магарача и селекционных форм, в семенном потомстве которых, в результате инцухта или перекрестного, свободного опыления, может проявляться гетерозис как по устойчивости к экстремальным факторам внешней среды, так и по качеству урожая. Даже при проведении скрещиваний по селекционным программам возникают сложности с выделением площадей под селекционные участки, которые требуют больших трудовых и экономических затрат. Поэтому первичная селекция на уровне семян может сократить затраты и расширить изучаемый гибридный генофонд как у винограда, так и у других сельскохозяйственных культур.
Нами поставлена задача разработать методики первичного отбора генотипов путем вымачивания семян в растворах биологически активных веществ, которые у устойчивых генотипов отдельных семян будут ускорять, а у неустойчивых - замедлять прорастание. В статье приводятся результаты действия биологически активных веществ как селективных факторов на прорастание семян и на эффективность отбора сеянцев по признакам силы роста побегов и степени вызревания лозы. Сеянцы, развившиеся из семян, которые взошли первыми после вымачивания в растворах биологически активных веществ, один год произрастают в поле. В дальнейшем будет проводиться их изучение по установлению коррелятивной зависимости между вариантами растворов, в которых вымачивали семена (взошли первыми) и признаками морозоустойчивости, устойчивости к активной извести в почве, продуктивности, раннеспелости, филлоксероустойчивости и т.д.

Место проведения исследований.

Для виноделия из сортов Тавквери Магарача, Кентавр Магарача и Данко урожай был доставлен из фермерского хозяйства Красногвардейского района АР Крым. После отжима сусла из выжимки были взяты семена для опыта 1 (табл.1). Сеянцы № 25 Первенец Магарача, № 52 Данко, № 36 Феркаль и № 19 Первенец Магарача произрастали на 34 селекционном участке (где и проводилось скрещивание), а также Мускаты белый, черный и розовый - на плантациях агрофирмы «Магарач» (ЮБК). В опыте 2 (табл.2) сеянцы сначала выращивали в гидропонной культуре в теплице физиологической площадки, а затем они были высажены в условия открытого грунта опытной базы «Дарсан» отдела селекции НИВиВ «Магарач».

Материалы и методы.

В первом опыте (табл.1) по вымачиванию семян в 27 вариантах растворов и оценке развития из них проростков использовали смесь семян после виноделия (настаивания сусла с кожурой и семенами в течение 3 сут. до начала интенсивного брожения). После отжима сусла семена отмывали от кожицы, остатков мякоти ягод и просушивали при комнатной температуре в течение трех недель. В смеси находились семена сортов селекции НИВиВ «Магарач»: Тавквери Магарача (60%), Кентавр магарачский (30%) и Данко (10%).
Во втором опыте (табл.2) для вымачивания в некоторых из вариантов растворов, представленных в табл.1, использовали семена свободного опыления сеянцев № 25 Первенец Магарача, № 52 Данко и смесь семян (после виноделия) Мускатов белого (30%), черного (10%) и розового (60%), а также семена скрещивания между сеянцами № 36 Феркаль Х № 19 Первенец Магарача. Сеянцы № 5 Первенец Магарача, № 52 Данко и № 19 Первенец Магарача свободного опыления, выросли из семян, взятых после виноделия у одноименных сортов. Сильнорослый сеянец № 36 Феркаль вырос из семени свободного опыления, семена были взяты из ягод маточника подвоев в агрофирме «Магарач» (пос. Вилино).

Методы.

Для проведения опытов 1 и 2 высушенные при комнатной температуре семена в течение трех недель были помещены в холодильник (+2°С, 4 недели), затем они были проморожены (-7°С, 8 сут.) и в дальнейшем просушены при 28-30°С в течение четырех недель. После просушки вес семян уменьшился приблизительно на 7%. Семена (табл.1) были разделены поровну по уровню в банках на 200 мл для всех 27 вариантов растворов. Раствор наливали в банки таким образом, чтобы уровень его был на 1 /3 выше уровня семян и при набухании семена находились в растворе. Семена замачивали в вариантах растворов на 1 сут. при комнатной температуре раствора (18°С). В опыте 1 (табл.1) семена отцеживали через сито, промывали водопроводной водой и высыпали в полиэтиленовые пакеты, в которых и выдерживали 10 сут. в термостате при 27°С и 4 сут. - при комнатной температуре (18°С).
Семена высыпали из пакетов на плоскую, размеченную в виде квадратов поверхность, в один слой.  

Таблица 1
Различия в прорастании смеси семян сортов винограда Тавквери Магарача, Кентавр магарачский и Данко после замачивания их (1 сут.) в различных вариантах растворов биологически активных веществ

Примечание: Основа растворов для вариантов 5-27 (в вариантах 6-27 - дополнительные добавки к основе растворов): 1/20 минеральных веществ и витаминов среды для размножения растений винограда invitro (1/20 среды PG [12] без сахарозы и регуляторов роста), нистатин - 0,5 таблетки/л (50000 ед. в одной таблетке), Na-бензоат - 150 мг/л, пиридоксин - 5 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л; Д,L-триптофан - 20 мг/л, CaCl2 - 1 г/л, гибберелловая кислота (ГА3) - 0,2 мг/л; N6-бензиладенин (БА) - 0,2 мг/л. рН вариантов растворов 5,6-5,8 (кроме вариантов растворов 19-23, рН которых составляет 10,8-11,9 после добавления Ca(OH)2, pH не доводили).

Таблица 2
Влияние содержания различных веществ в вариантах растворов (табл.1) для вымачивания семян перед высевом их в теплицу на отбор сеянцев в конце вегетации по силе роста побегов и степени вызревания лозы


Популяции сеянцев

Вариант раствора

Количество сеянцев, высаженных в поле

Количество сеянцев с различной длиной (11, 12, 13), в % от высаженных в поле

Средняя длина побегов для данной популяции сеянцев, см

Отличия от средней длины побегов для данной популяции сеянцев, %

Вызревание лозы, в % от общей длины побегов

Отличия от среднего % вызревания лозы для данной популяции сеянцев, %

шт.

в % от кол-ва семян

11<50 см

50 см<12 <150 см

l3>150 см

1. № 25 Первенец Магарача Х свободное опыление (1700 шт. семян, по 243 шт. на вариант раствора)

6

2

0,8

100

0

0

29,5

-80,6

79,7

+27,9

9

2

0,8

50

50

0

62,5

-59,0

60,0

-3,7

10

3

1,2

33

33

33

212,0

+39,2

79,6

+27,8

14

1

0,4

0

0

100

285,0

+87,1

88,5

+42,1

16

0

0

0

0

0

0

-100

0

-100

23

2

0,8

0

100

0

116,0

-23,8

61,6

-1,1

25

1

0,4

0

0

100

361,0

+137,0

66,7

+7,1

Сред. значения

 

1,8

0,6

26,1

26,1

33,3

152,3

 

62,3

 

№ 52 Данко Х свободное опыление (1100 шт. семян, по 183 шт. на вариант раствора)

6

6

3,3

33

67

0

61,7

-43,0

67,6

-6,5

10

11

6,0

17

66

17

116,0

7,1

75,9

+4,9

14

7

3,8

0

100

0

101,0

-6,7

61,1

-15,5

16

8

4,4

13

62

25

104,1

-3,9

67,7

-6,4

23

7

3,8

29

14

57

143,9

+32,9

86,7

+19,9

25

4

2,2

25

50

25

123,0

+13,6

74,6

+3,2

Сред. значения

 

7,3

4,0

19,5

43

20,7

108,3

 

72,3

 

№ 36 Феркаль Х № 19 Первенец Магарача (800 шт. семян, по 200 шт. на вариант раствора)

9

4

2,0

0

0

100

284,8

+35,8

68,1

-2,3

14

5

2,5

0

0

100

193,4

-7,8

67,4

+1,2

16

2

1,0

0

50

50

169,5

-19,2

64,0

-3,9

23

3

1,5

0

0

100

191,0

-8,9

67,0

+0,6

Сред. значения

 

3,5

1,8

0

12,5

87,5

209,7

 

66,6

 

Мускаты белый, черный и розовый Х свободное опыление (1100 шт. семян, по 220 шт. на вариант раствора)

6

1

0,5

0

0

100

230,0

+40,7

65,2

+29,1

10

3

1,4

0

0

100

220,3

+34,7

65,8

+30,3

14

0

0

0

0

0

0

-100

0

-100

16

2

0,9

0

100

0

139,0

-15,0

68,4

+35,5

25

7

3,2

0

0

100

228,3

+36,6

53,1

+5,2

Сред. значения

 

2,6

1,2

0

20

60

163,5

 

50,5

 

Средние значения для всех популяций сеянцев для каждого варианта раствора (всего 4700 шт. семян, по 443-846 шт. на вариант раствора)

6

9

1,4

44,3

22,3

33,3

107,1

-31,8

70,8

+17,6

9

6

1,4

25,0

25,0

50,0

173,7

+10,6

64,1

+6,5

10

17

2,6

16,7

33,0

50,0

182,8

+16,4

73,8

+22,6

14

13

1,5

0

25,0

50,0

144,9

-7,8

54,3

-9,8

16

12

1,4

3,3

53,0

18,8

103,2

-34,3

50,0

-16,9

23

12

1,9

9,7

38,0

52,3

150,3

-4,3

71,8

+19,3

25

12

1,9

8,3

16,7

75,0

237,4

+51,1

64,8

+7,6

Средние значения для всех популяций сеянцев и для всех вариантов растворов

 

81

1,7

15,3

30,4

47,1

157,1

 

60,2

 

Подсчитывали количество проросших семян в одном квадрате, затем их количество умножали на количество квадратов, которые они занимали.

В опыте 2 (табл.2) после вымачивания в вариантах растворов (1 сут.) и отмывки в воде, семена в первой половине мая были высеяны в гравийную гидропонную культуру на расстоянии примерно 1 см друг от друга, сплошными участками на глубину 3 см. Между каждым вариантом раствора каждой популяции семян были промежутки без высеянных семян шириной 10 см.
В конце июня был проведен первый отбор сеянцев в теплице: слабые или только взошедшие сеянцы удалили, оставили самые сильные, которые взошли первыми. Для каждой популяции сеянцев каждого варианта раствора, в котором вымачивали семена, было оставлено для вызревания лозы следующее количество сеянцев: № 25 Первенец Магарача - по 37 сеянцев на каждый вариант раствора, № 52 Данко - по 36 сеянцев, № 36 Феркаль Х №19 Первенец Магарача - по 35 сеянцев и Мускаты белый, черный, розовый (смесь семян) - по 15 сеянцев.
В конце вегетации, в ноябре, провели второй отбор сеянцев в теплице для их пересадки в условия открытого грунта: отбирали сеянцы, у которых вызревшая лоза была больше 30 см. В декабре сеянцы были высажены в поле, в траншею на расстоянии 15 см друг от друга, на поливной участок с хорошим верхним слоем почвы (25-30 см). Сверху вызревшую лозу засыпали слоем почвы 5-8 см. Весной в почву были внесены азотные, калийные и фосфорные удобрения. В конце вегетации, в октябре-ноябре, у каждого сеянца проводили замеры общего прироста лозы (см), вызревшей части лозы (см) и рассчитывали степень вызревания лозы как отношение длины вызревшей лозы к ее общей длине (%).
В табл. 2 приводятся результаты по влиянию вымачивания семян в различных вариантах растворов на их развитие в теплице (количество сеянцев, отобранных для пересадки в поле с длиной вызревшей лозы больше 30 см), а также их развитие в конце вегетации в поле.
Отличия показателей влияния варианта раствора от контроля (табл.1) и от общего среднего значения показателя для всех растворов для данной популяции сеянцев (табл.2) рассчитывали в процентах: (100% X значение показателя для варианта раствора): (значение показателя для контроля или среднее значение показателей для всех растворов для данной популяции сеянцев) - 100%.

Результаты.

Добавка различных, биологически активных веществ в варианты растворов для вымачивания семян (табл.1) привела как к увеличению, так и к уменьшению процента прорастания семян, влияла на размер проростков и развитие у них корней. По сравнению с контролем (вымачивание семян в Н2О), добавка в растворы нистатина, триптофана, комплекса веществ, находящихся в основе раствора, и добавка к основе раствора Са(ОН)2 (200-350 мг/л), триптофана (100 мг/л) и пирокатехина (50 мг/л) увеличивала процент прорастания семян. Развивались длинные гипокотили (30-40 мм) под влиянием присутствия в растворе Са(ОН)2 в концентрациях 100-500 мг/л. Кроме того, стимулирующее действие 350 и 500 мг/л Са(ОН)2 и 50 мг/л пирокатехина на развитие проростков проявлялось в их освобождении от оболочек семян - выходе семядолей из семян. Существенное улучшение развития корней из проростков (6-7 баллов) происходило после вымачивания семян в растворах с триптофаном (20 мг/л), с добавкой к основе раствора ауксинов ИУК (5 мг/л) и НУК (1 мг/л) по отдельности и совместно даже с БА (1 мг/л) и 2,4-Д (0,2 мг/л). Хорошо развивались корни (4-5 баллов) у проростков после добавки к основе растворов 2,4-Д (0,2 мг/л), БА (1 мг/л), Са(ОН)2 (200-1000 мг/л) и 50 мг/л пирокатехина (табл.1).
Но нашей главной задачей было подобрать вещества, обладающие селективным действием на прорастание семян, а именно: после замачивания семян в растворах с определенными веществами первыми будут прорастать семена, генотипы которых определяют устойчивость к этим веществам - экстремальным факторам, а неустойчивые семена не будут прорастать вовсе или их развитие будет замедленным. Поэтому селективное действие веществ в растворах проявляется в снижении процента их прорастания по сравнению с контрольными растворами: Н2О и комплексом веществ в основе раствора. Такими экстремальными факторами, снижающими процент прорастания семян и замедляющими развитие гипокотилей, являются добавленные совместно к основе растворов высокие концентрации ауксинов - 5 мг/л ИУК и 1 мг/л НУК (вариант 9), Д-манит (30-200 г/л) (варианты 15-18) и Са(ОН)2 (1000 мг/л, вариант 23). Отмечается селективное действие веществ в растворах (снижение процента прорастания семян) при увеличении концентраций Д-манита и Са(ОН)2, а также, хоть и незначительно, пирокатехина (от 50 до 200 мг/л) (табл.1).
Чтобы установить действие биологически активных веществ в качестве селективных факторов путем стимулирования или ингибирования прорастания семян с определенными генетически детерминированными хозяйственно ценными признаками, после обработки семена были высеяны в теплицу, а выращенные сеянцы были высажены в почву, в условия открытого грунта. Для этого в некоторые из растворов (варианты 6, 9, 10, 14, 16, 23, 25, табл.1) были замочены на одни сутки семена свободного опыления сеянцев № 25 Первенец Магарача, № 52 Данко, смесь семян Мускатов белого, черного и розового, а также семена скрещивания сеянцев № 36 Феркаль Х №19 Первенец Магарача (табл.2).
После обработки растворами семена были высеяны в теплицу, в гидропонную культуру. В конце июня были удалены слабые сеянцы. Было оставлено от 14 до 40 сильных сеянцев, выросших из семян каждой популяции, вымоченных в каждом из вариантов растворов (табл.2). В конце вегетации были отобраны сеянцы с длиной вызревшей лозы не менее 30 см для высадки в условия открытого грунта. Больше всего сеянцев (17 шт., среднее значение показателя для всех популяций сеянцев, табл.2) было отобрано после вымачивания семян в варианте раствора 10 с высокой концентрацией регуляторов роста ИУК (5 мг/л), НУК (1 мг/л) и БА (1 мг/л), меньше всего - в растворе 9, с этими же ауксинами (ИУК и НУК), но без БА (для высадки в поле отобрано 6 сеянцев) и после вымачивания семян в основе раствора с добавкой 20 мг/л гистидина (вариант 6, 9 шт. сеянцев).
После высадки отобранных сеянцев в условия открытого грунта, в конце вегетации, в октябре, проводили замеры общей длины побегов, вызревшей части лозы и определяли степень ее вызревания (отношение длины вызревшей лозы к общей длине лозы х 100%) у каждого сеянца. Из семян, обработанных раствором 14 с добавлением всех регуляторов роста (ИУК, НУК, БА и 2,4Д) в поле выросли сеянцы с побегами больше 50 см. Самая длинная лоза была у сеянцев, отобранных после вымачивания семян в растворе 25 с добавлением 100 мг/л триптофана, у 75% сеянцев лоза была больше 150 см, средняя длина лозы - 237,4 см, которая на 51,1% превышала среднюю длину для всех растворов и популяций сеянцев. Лучшее вызревание лозы было у сеянцев, выросших из семян, которые были вымочены в растворе 10 с ИУК, НУК, БА и в растворе 23 с добавкой 1000 мг/л Са(ОН)2: степень вызревания лозы превышала средний показатель на 22,6 и 19,3% соответственно.
Между сеянцами, полученными из семян, вымоченных в различных вариантах растворов, у популяции скрещивания № 36 Феркаль Х № 19 Первенец Магарача по признакам прироста и вызревания лозы было меньше различий, чем между сеянцами популяций свободного опыления № 25 Первенец Магарача, № 52 Данко и Мускатов белого, черного и розового (табл.2). Происходил отбор путем ингибирования прорастания семян с признаками слабого роста побегов и с плохим вызреванием лозы под воздействием определенных биологически активных веществ в вариантах растворов. У сеянцев свободного опыления разные опылители - отцовские формы, больше генетическая разнородность и больше возможностей для отбора под воздействием селективных факторов - биологически активных веществ, которые могут замедлять или ускорять прорастание семян не только с признаками разной силы роста побегов и степени вызревания лозы у винограда, но, возможно, и по другим хозяйственно ценным признакам, что необходимо изучить в дальнейшем.

Выводы.

Различные биологически активные вещества, добавленные в растворы для вымачивания семян, влияли на процент их прорастания, размер проростков и в дальнейшем - на отбор сеянцев по признакам силы роста побегов и степени вызревания лозы.
По сравнению с контролем (вымачивание семян в Н2О), добавление в растворы, по отдельности, нистатина, триптофана, комплекса веществ, находящихся в основе раствора, и добавление к основе раствора 200-350 мг/л Са(ОН)2, 100 мг/л триптофана и 50 мг/л пирокатехина - увеличивало процент прорастания семян.
Наибольшее стимулирование развития корней у проростков происходило после вымачивания семян в вариантах растворов, содержащих 20 мг/л триптофана, ауксины ИУК (5 мг/л) и НУК (1 мг/л) по отдельности и совместно.
В качестве экстремальных факторов, которые снижали процент прорастания семян, были добавленные в растворы для вымачивания высокие концентрации ауксинов ИУК (5 мг/л) и НУК (1 мг/л), 30-200 г/л Д-манита и 1000 мг/л Са(ОН)2.
Проявлялось селективное действие веществ, находящихся в растворах для обработки семян, в снижении процента их прорастания при увеличении концентраций Д-манита (30 г/л → 200 г/л), Са(ОН)2 (500 мг/л → 1000 мг/л) и пирокатехина (50 мг/л → 200 мг/л).
Селективное действие веществ, добавляемых в растворы для вымачивания семян, проявлялось в ингибировании или стимулировании прорастания семян с определенными генетически детерминированными признаками, в частности, такими как сила роста побегов и степень вызревания лозы. Наибольший прирост побегов был у сеянцев, развившихся из семян, обработанных раствором с добавлением 100 мг/л триптофана; наилучшее вызревание лозы отмечено у сеянцев, выросших из семян, вымоченных в основе раствора с добавлением 5 мг/л ИУК, 1 мг/л НУК и 1 мг/л БА, а также с добавлением 1000 мг/л Са(ОН)2.
Границы проявления признаков (сила роста побегов и степень вызревания лозы) у сеянцев, выросших из семян, вымоченных в различных вариантах растворов биологически активных веществ, зависят от величины гетерогенности (гетерозиготности) сеянцев в популяции: у сеянцев свободного опыления они больше, чем у сеянцев определенного скрещивания (в частности, № 36 Феркаль Х №19 Первенец Магарача).

Заключение.

Метод отбора сеянцев путем вымачивания семян в растворах биологически активных веществ, которые замедляют или ускоряют прорастание семян с определенными генетическими признаками, можно использовать не только для отбора сильнорослых сеянцев с хорошим вызреванием лозы, но, по-видимому, для отбора сеянцев, обладающих другими хозяйственно ценными признаками, такими как морозоустойчивость, устойчивость к высокой концентрации активной извести в почве, солеустойчивость, засухоустойчивость, филлоксероустойчивость, раннеспелость, продуктивность и др.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. - К.: Наукова думка, 1984. - 157 с.
  2. Сидоров В.А. Биотехнология растений, — К.: Наукова думка, 1990. — 385 с.
  3. Lebrun L., Rajasekaran K., Mullins M.G. Selection in vitro for NaCl-tolerance in Vitis rupestris Scheels// Annals Botany/ —       1985/ Vol.56. — P.733—739.
  4. Zhang M., Rajashekar C.B. Selection of cold tolerant cells of grapes in suspension culture// Plant. Sci. (Shannon). — 1994. — Vol.97. — P.69-74.
  5. Зленко В.А., Котиков И.В., Трошин Л.П. Математическое планирование эксперимента с целью оптимизации концентрации веществ в питательной среде для развития каллус- ной ткани винограда с последующей селекцией на клеточном уровне// Биотехнология. — М.: «Академия биотехнологии». Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН. — 2005. — №6. — С.63-73.
  6. Jayasankar S., Li Z., Gray D.L. In vitro selection of Vitis vinifera «Chardonnay» vith Elsinoe ampelina culture filtrate is accompanied by fungal resistance and anchanced secretion of chitinase// Planta. — 2000. — Vol.211. — P.20-208.
  7. Зленко В.А., Трошин Л.П. Соматический эмбриогенез в суспензионной культуре винограда in vitro// Цитология и генетика. — 1983. — Т.27. — №3. — С.53-63.
  8. Zlenko V.A., Trochine L.P. Selection clonade de la vigne// Proc. of the 74 Assemble generale de la vigne et du vin. Viticulture. — Vol. 1. — Juin 6—10, 1994. — Paris, 1994. — P.1-14.
  9. Зленко В.А., Трошин Л.П. Клоновая селекция винограда in vitro// «Магарач». Виноградарство и виноделие. — Ялта: ИВиВ «Магарач», 1995. — №1. — С.12-19.
  10. Zlenko V.A., Kotikov I.V., Troshin L.P. Efficient GA3 — assisted plant regeneration from cell suspensions of three grape genotypes via somatic embryogenesis// Plant Cell, Tissue and Organ Culture. — 2002. — Vol.70. — № 3. — P.295-299.
  11. Zlenko V.A., Kotikov I.V., Troshin L.P. Effects of IAA and BA on development of globular, heart — and torpedo-stage embryos from cell suspensions of three grape genotypes// Scientia Horticulturae. — 2005. — Vol. 104. — P.237-247.
  12. Зленко В.А., Павлова И.А. Метод культивирования растений винограда в условиях in vitro в стерильном песке, обогащенном питательным раствором// Магарач. Виноградарство и виноделие. — 2012. — №4. — С.14-16.