Индуцированная полиплоидизация у винограда

Волынкин В.А. д.с.-х.н. нач. отдела селекции, генетики винограда  и  ампелографии
Лиховской В.В. зав. сектором питомниководства
Павлова И.А. с.н.с., к.с. – х.н.
Зленко В.А., н.с., к.с. – х.н.
Олейников Н.П. в.н.с., к.с. – х.н.
Национальный институт винограда и вина «Магарач»

При выведении новых сортов отвечающих современным условиям биосферы с генетической обусловленностью селектируемых биологических и хозяйственно-ценных признаков, перспективным направлением в селекции винограда на создание бессемянных сортов является сочетание в одном генотипе бессемянности с  устойчивостью к неблагоприятным воздействиям внешней среды, возбудителям болезней, вредителям. Но сегодня для конкурентоспособности столового винограда на рынке необходимо учитывать, также размер и окраску ягод, величину грозди, что в целом определяет товарность продукции сорта. Проведенными ранее исследованиями установлено, что линейные размеры ягод коррелируют с массой семян в ягодах, поскольку в семенах синтезируются гиббереллины, и чем больше масса семян в ягодах, тем они больше их продуцируют, тем крупнее ягоды. В связи с существованием такой закономерности пока не получены бессемянные сорта винограда с ягодами крупнее 6 г [8].
С другой стороны в биологии известна возможность существования фертильных растений с увеличенным набором хромосом (полиплоидов). У полиплоидных организмов увеличиваются размеры репродуктивных органов (цветков, плодов и семян), повышаются пластичность и устойчивость к условиям окружающей среды, что в конечном итоге ведет к значительному увеличению их адаптивного потенциала [9].  Имеются сведения о получении полиплоидных форм винограда с помощью колхицина [4, 5].  
Целью настоящих исследований являлось получение крупноягодных полиплоидных бессемянных форм винограда путем гибридизации  обработанных колхицином  материнских и отцовских форм, изучение влияния применения колхицина на почках виноградного растения на формирование полиплоидных органов, определение фазы развития для обработки, подбор концентраций раствора, установление  продолжительности обработки для получения полиплоидных побегов, соцветий.
В  опыте использовали в качестве исходных шесть материнских гибридных форм (далее г.ф.), имеющих функционально женский тип цветка, из которых генотип трех был сформирован на основе использования генома бессемянных сортов.
Из генеалогической схемы  получения г.ф. Талисман видно, что эта г.ф. - сложный межвидовой гибрид, генотип которого сложился на основе генов различных видов рода Vitis (Tournef.)L. подрода Euvitis Planch и всех трех эколого-географических групп вида Vitis vinifera L.: восточная группа представлена сортами Ката Курган, Нимранг; бассейна Черного моря – сортами Додреляби, Галан; западноевропейская - сортом Сеянец Маленгра; представителем Северной Африки, является сорт Шасла. Виды Северной Америки представлены сортом Конкорд и гибридами этих видов, а восточно-азиатский вид - диким амурским виноградом (рис 1).
У г.ф. Талисман отмечаются очень крупные по размеру и массе грозди до 5 кг и  крупные ягоды массой до 24 г. Но исходные родительские формы (материнская – Фрумоаса албэ и отцовская – Восторг) не обладают такой крупной ягодой, что позволяет говорить о проявлении гетерозиса по массе ягоды у винограда в F1.
Одними из доноров крупноягодности г.ф. Талисман могут являться столовые сорта Ката Курган и Нимранг. Эти сорта относятся к восточной эколого-географической группе и являются сортами позднего срока созревания, с функционально-женским типом цветка. Сорт Ката Курган обладает, так же как и г.ф. Талисман округло-овальной очень крупной зелено-желтой ягодой, но масса ягоды может достигать до 12 г, что в 2 раза меньше, чем у  полученной формы. У сорта Нимранг обратнояйцевидные или округлые ягоды, розовой окраски и масса ягод до 10 г. Какие-либо другие сорта с крупной ягодой не использовались при формировании генома г.ф Талисман. Необходимо также отметить, что прямые исходные родительские формы Фрумоаса албэ и Восторг имеют ягоды до 8 г., то есть они даже менее крупные, чем у сортов Нимранг и Ката Курган. Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать, что в F1 может наблюдаться отрицательный гетерозис (депрессия) по массе ягод (сорта Фрумоаса албэ и Восторг), но с другой стороны истинный гетерозис по массе ягоды (г.ф. Талисман) может наблюдаться как в F2 от доноров крупноягодности (Катта Курган и Нимранг).
Устойчивость к возбудителям грибных болезней у эколого-географической группы восточных сортов определяется на уровне 4 – 5 баллов (по пятибалльной шкале, где степень устойчивости определяется от 1 до 5 баллов, и более высокий балл определяет меньшую устойчивость). Морозоустойчивость у этих сортов низкая до -18 ºС. Поэтому по всей вероятности высокую морозостойкость до - 25ºС  г.ф. Талисман унаследовала от амурского винограда,  а устойчивость к болезням  3 – 3,5 балла от американских видов.
Следует отметить, что семена г.ф. Талисман обладают хорошей всхожестью, до 40 %, а развившиеся сеянцы характеризуются высокой жизнеспособностью. Учитывая эти отмеченные особенности г.ф. Талисман, функционально женский тип цветка, а также высокую частоту передачи своему гибридному потомству признака крупноплодности ягод, эту г.ф. можно считать перспективной для использования в селекции винограда на крупноплодность и донором этого признака.
      На примере г.ф. Подарок Запорожью полученной, в результате гибридизации г.ф. Талисман и сорта Восторг, наблюдается передача признака крупноплодности ягод, от исходной материнской формы Талисман. Данная г.ф. обладает повышенной устойчивостью к грибным заболеваниям милдью и оидиуму.
В результате скрещивания г.ф. Талисман с бессемянным сортом Кишмиш лучистый получена г.ф. Гурман ранний, для которой характерно наследование признака   крупноплодности ягод от исходной материнской формы Талисман, что подтверждает перспективность использования г.ф. Талисман в качестве донора признака крупноплодности.
Следующая участвующая в гибридизации, отобранная по биологическим свойствам - гетерозисная г.ф София (рис 2). Исходными родительскими формами этой г.ф. являются материнский обоеполый сорт Аркадия и отцовский сорт Кишмиш лучистый. Из схемы видно, что эта г.ф. не имеет, такой сложной межвидовой структуры генотипа как г.ф. Талисман. В частности, в генотипе г.ф. София не присутствует амурский виноград способный передавать высокую морозостойкость, а также не отмечается, устойчивость к возбудителям болезней и вредителям, которая могла бы быть унаследована от СВ 12-375, но с другой стороны у г.ф София в результате гетерозиса отмечается масса ягоды до 16 г. и грозди до 3 кг. Донорами крупноягодности в данном случае также является сорт Ката Курган и Кардинал, у которых масса ягоды достигает до 10-12 г. Также у этой г.ф. наблюдается наследование нарядной розовой окраски от сорта Кишмиш розовый и мускатного аромата от сорта Кардинал.
В целом, необходимо отметить, что основной принцип подбора материнских исходных форм заключался в  передаче ими гибридному потомству крупноплодности ягод, величины грозди, нарядной окраски а также  различных сроков созревания.
На основе проведенных ранее скрещиваний представленных г.ф. в потомстве с Vitis vinifera были получены семенные формы неустойчивые к условиям внешней среды, возбудителям болезней и вредителям. Поэтому в гибридизацию включались отцовские бессемянные сорта обладающие устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам (табл 1).
Таблица 1.
Сорта, отобранные для гибридизации по ряду
хозяйственно-ценных признаков.

      Кроме того, отцовские бессемянные сорта подбирались по различным срокам созревания с участием сортов имеющим в генотипе только вид V. vinifera. К ним относятся Сверхранний бессемянный Магарача сорт раннего срока созревания, Кишмиш лучистый – среднего, Кишмиш Молдавский – позднего. Скрещивания проводились по циклической схеме.
Таким образом, в опыте участвуют исходные формы с наиболее крупными ягодами и обладающие устойчивостью к абиотическим и биотическим факторам и проявившие себя в качестве доноров высокой степени выраженности данных признаков при передаче их потомству. Применение же колхицина должно обеспечить получение у исходных форм гамет с двойным набором хромосом, что в свою очередь при гибридизации позволит получить или тетраплоидные или триплоидные гибриды, которые будут иметь увеличенные размеры как ягод, так и гроздей. Применение колхицина при обработке почек исходных материнских и отцовских форм с диплоидным набором хромосом основано на формировании искусственных полиплоидных генеративных органов на диплоидных кустах.
Для определения соответствующих сроков и концентраций применения колхицина были проведены  в 2006-2008 годах обработки почек в два срока: 1) во время их распускания; 2) во время закладки в них генеративных органов. Для обработки применялись концентрации колхицина в растворе Н2О: 0,12; 0,25, и 0,5 %. Раствор колхицина  наносился на ватный тампон, который накладывался непосредственно на почку и обвязывался эластичным влагонепроницаемым материалом, пропускающим воздух [2].
Изменения побегов и листьев наблюдались только в варианте обработки 0,5% раствором колхицина. Побеги имели утолщенную форму с короткими междоузлиями. Листья очень сильно отличались от контроля и имели гофрированную форму, с интенсивной темно-зеленой окраской.  На два узла выше соцветия наблюдалось разветвление побегов. После разветвления развивались побеги  с обычной толщиной и длиной междоузлий свойственной исходной форме. Таким образом, полученные побеги до ветвления, в результате обработки раствором колхицина в концентрации 0,5 %, соответствовали по вышеизложенным морфологическим признакам полиплоидным формам. Раздвоенные побеги по морфологическим признакам, по всей вероятности, являлись диплоидными. На полученных полиплоидных побегах сформировались соцветия, которые были использованы во время цветения для гибридизации [4].
В 2008 г.  с целью подтверждения правильности выбранного метода колхицинирования был проведен цитологический анализ. Побеги из обработанных колхицином  почек при достижении 2 - 4 см были срезаны и помещены в фиксирующий раствор состоящий из уксусного алкоголя, на 12 часов. После этого зафиксированные побеги были извлечены из уксусного алкоголя и законсервированы  в 70 % спирте.
Цитологический анализ зафиксированных побегов был проведен на кафедре физиологии растений  Таврического Национального Университета г. Симферополь (Бугара А. М., Теплицкая Л. М., Бугара И. А.). Приготовление красителя, окрашивaниe и приготовление препаратов проводилось согласно методике [7]. На фотографии метафазной пластинки хромосом полученной с препарата г.ф. Талисман  видно, что количество хромосом больше 50, но точнее подсчитать не удалось. На фотографиях видны oтдeльные хромосомы, но из-за глубины препарата хромосомы лежат в нескольких плоскостях. Тем не менее, проведенный цитологический анализ и полученные фотографии подтверждают, что в результате обработки колхицином удалось получить миксоплоидные формы винограда, которые были использованы в гибридизации [1].
В результате проведенной гибридизации образовавшиеся ягоды у г.ф. Талисман после обработки колхицином почек во время закладки в них генеративных органов (опыт 2) имели вытянутую ассиметричную форму в отличие от слегка овальной формы ягод  присущей, этой г.ф. Были получены семена, размеры которых существенно варьировали. Семена отличались формой, и если у контрольных семян наблюдается вытянутая форма, то  в опыте после обработки колхицином  отмечаются более округлые, выпуклые семена.  Полученные семена были высеяны в гидропонику, часть на питательную среду в культуру in vitro, некоторые из них проросли и выросли сеянцы [1].
У винограда отмечается низкая всхожесть семян порядка 30 %, а у сортов очень раннего срока созревания наблюдается еще меньшая всхожесть семян. Однако для того чтобы вести селекционную работу направленную на раннеспелость более результативно использовать в гибридизации раннеспелые формы в качестве материнских. Для получения растений из семян сортов имеющих очень ранний срок созревания, таких как Лора и София, применялось введение недозревших семян в культуру in vitro. В результате скрещиваний в 2008 году в некоторых комбинациях было получено очень небольшое количество семян и чтобы не потерять уникальный генофонд, они были высажены в культуру in vitro.  
Таблица 2.
Культивирование гибридных семян винограда, полученных после обработки почек колхицином,  в культуре in vitro.

   Как видно из таблицы, несмотря на культивирование семян в культуре in vitro в комбинациях скрещиваний Талисман х Ялтинский бессемянный, Подарок Запорожью х Венера, Подарок Запорожью х Ялтинский бессемянный растения получить не удалось. Из 135 гибридных семян полученных в результате скрещиваний Лора х Русбол улучшенный было выращенно и высажено на адаптацию, 15 растений, Лора х Кишмиш лучистый из 75 семян получено 13 растений, и в контрольном скрещивании без обработки колхицином  Лора х Кишмиш лучистый из172 семян получено 37 растений.
Семена сортов среднего срока созревания были высажены в гидропонные каналы (табл 3).                      
Таблица 3.
Культивирование гибридных семян винограда,
полученных после обработки почек колхицином, в гидропонной культуре.

     Как видно из таблицы гибридные семена формы Подарок Запорожью имеют большую жизненную силу и в результате хорошую всхожесть. Даже в комбинации скрещиваний Подарок Запорожью х Ялтинский бессемянный из 20 семян получено 13 растений, тогда как из 4 недозрелых семян этой комбинации, в культуре in vitro не получено ни одного.  Растения так же как и в культуре in vitro существенно отличались по силе роста.
В результате в 2009 г. получено 233 растения (табл 4.), которые весной 2010 г высажены в поле на постоянное место для дальнейшего изучения. В отличие от контрольных сеянцев у которых корни имеют выровненное строение, у полученных гибридных сеянцев корни имеют бугристое с перетяжками морфологическое строение (рис 3).
Таблица 4.
Полученные растения в результате гибридизации колхицинированных исходных форм

 
В 2009 г. работа по гибридизации обработанных 0,5 % раствором колхицина  почек исходных форм была продолжена (табл 5). В гибридизацию были вовлечены сорта Катта Курган, Нимранг, Чауш, Чауш розовый, Чауш черный. В результате 51-ой комбинаций скрещиваний было получено 3604 семян.
Таблица 5
Гибридизация и резульаты получения гибридного материала
колхицинированных исходных форм

   В 2010 г. часть гибридных семян посеяна в гидропонные каналы на вегетационной площадке института «Магарач» г. Ялта, часть в контейнеры с субстратом и последующей посадкой развившихся сеянцев в контейнерах в тепличный комплекс ГП Агрофирма «Магарач» с. Вилино.
Можно предположить, что в потомстве будут получены полиплоидные формы, обладающие более крупными ягодами и гроздями, чем исходные диплоидные семенные и бессемянные сорта.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

• Волынкин В.А., Зленко В.А., Лиховской В.В. Селекция винограда на бессемянность, крупноплодность и раннеспелость на полиплоидном уровне. // Сборник научных трудов НИВиВ «Магарач», Ялта – Т ХХХIХ. – 2009. С. 9-13.
• Волынкин В.А., Зленко В.А., Лиховской В.В. Селекция винограда на бессемянность на полиплоидном уровне. // Тезисы докладов и сообщений Международной научно-практической конференции, посвященной 180-летию НИВиВ «Магарач». – 2008. – Т.1. – Ялта, - С. 92 – 94.
• Волынкин В.А., Макрушин Н.М., Лиховской В.В. Использование метода полиплоидизации в селекции винограда на бессемянность. // Геном растений. Сборник научных трудов V Международной конференции. / Южный биотехнологический центр растениеводства УААН. – Одесса, 2008. – С. 58-61.
• Голодрига П.Я., Топалэ Ш.Г. Экспериментальное получение тетраплоидных форм винограда/ III Всесоюз. совещ. по полиплоидии: Тез. докл. Минск, 1970. – С.117-118.
• Киреева Л.К. Новые методы в селекции винограда. Ялта: ВНИИВиПП «Магарач». – 1991. – 140 с.
• Лиховской В.В., Зленко В.А., Волынкин В.А. Полиплоидизация в селекции винограда на бессемянность. Тезисы докладов Международной научной конференции, посвященной 200-летию Ч. Дарвина и 200-летию Никитского ботанического сада. 2009. – Ялта, - С. 89.
• Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. – М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.
• Смирнов К.В., Кострикин И.А., Майстренко Л.А., Шевцов А.Н., Бельчиков Э.А. Ключиков Е.А. Бессемянные сорта и гибридные формы винограда. Новочеркасск-Запорожье: Дар. – 2002. – 54 с.
• Топалэ Ш.Г. Полиплоидия у винограда. Кишинев: Штиница. – 1983. – 216 с.