Производство вина с подогревом винограда - Влияние нагревания мезги красного винограда на микрофлору и процессы брожения

Дрожжи

В своем исследовании, результаты которого обобщены в этом разделе, Сапи-Домерк и Пейно (1974) поставили целый ряд задач. К этому времени уже было известно, что мезга, нагреваемая до температур, превышающих те, при которых происходит отмирание дрожжей, легко вступает в брожение. Последнее может начаться и продолжаться при температурах, которых обычно дрожжи не выдерживают. Эти факты можно было объяснить или неполной стерилизацией мезги и селекцией термостойких рас дрожжей, или, если стерилизация была эффективной, быстрым размножением новых дрожжей в нагретой мезге. Активация брожения могла бы быть обусловлена в этом случае образованием активаторов.
Для проверки этих гипотез была проведена серия опытов, которые включали подсчет живых дрожжевых клеток и идентификацию изолированных рас. Виноград после дробления и отделения гребней нагревали приблизительно до 75°С. После этого или охлаждали мезгу и направляли ее в бродильные чаны (виноделие по красному способу), или же нагретую мезгу прессовали в горячем состоянии. Получаемое при этом окрашенное сусло подвергали быстрому охлаждению и спонтанному брожению в чане (виноделие по белому способу).
Пробы отбирали стерильно в разные моменты операций на линии термической обработки. При транспортировке в лабораторию целый виноград помещали в мешки из стерильной ткани, защищенной фильтровальной и стерильной бумагой. Образцы мезги помещали в стерилизованные банки. Дрожжи из мезги выделяли на твердую среду после тщательного перемешивания, отбирая виноградный сок. Для нераздробленного винограда использовали метод Барнета и сотрудников (1972), который включает диспергирование миксером и дает значительно более высокие и надежные популяции дрожжей, чем метод простого раздавливания рукой, при котором большая часть дрожжевых клеток остается приставшей к кожице (Белен и Анри, 1972).
Метод Барнета заключается в том, что из каждого мешка с виноградом отбирают с помощью стерильного пинцета по 30 ягод (от 40 до 50 г), которые помещают во вращающуюся дробилку (миксер) из нержавеющей стали. Корпус миксера, его крышку и ножи предварительно стерилизуют; измельчение длится 30 с. Из 1 мл сока, полученного из мякоти, приготовляют серию разбавлений в пробирках, содержащих по 10 мл стерильной воды. Затем с помощью калиброванной пипетки Пастера отбирают по две капли (по 0,25 мкл) из каждого раствора; каждую каплю распределяют тонким слоем на половине поверхности чашки Петри; питательной средой служат желатин и виноградное сусло. Перевернутые чашки ставят на инкубацию в течение пяти дней при 25°С. Обычно используют разбавления 10-1, 10-2, 10-3, 10-4. Чтобы привести объем капли, равный 0,25 мкл, к 1 мл, нужно умножить число колоний, полученных для одной капли, на 4-10+2, 4-10+3, 4-10+4, 4-10+5 соответственно.
Образцы сусла или мезги хранили 15 дней в лаборатории, после чего производили второй отбор колоний. Полученные чашки Петри служили одновременно и для подсчета колоний дрожжей, и для отбора их с целью идентификации рас.
Что касается подсчета дрожжей во время различных фаз нагревания винограда или мезги, какую бы систему нагревания ни применяли, выдерживая среду в течение нескольких минут при 75°С, получают практически полную стерилизацию даже в тех случаях, когда мезга или виноград уже стали очагом развития дрожжей. Безусловно, можно достичь стерильности и при менее высоких температурах нагревания.
Число дрожжевых клеток в 1 мл, которое в суслах или в винограде до нагревания составляло несколько сот тысяч или несколько миллионов, снижается практически до нуля сразу же после нагревания и значительно повышается во время последующих операций. Популяция быстро возрастает и становится больше той, которая существовала до нагревания. Стерильная фаза длится, пока виноград еще горячий, а затем обсеменение происходит более или менее быстро в зависимости от условий. Вероятно, все операции с нагретой и стерилизованной мезгой — перекачка насосами, перемешивание, прессование, охлаждение и др. — сопровождаются массовым внесением дрожжей. Обсеменение через все виды оборудования происходит быстро. Мало надежд на то, чтобы при нынешнем оборудовании можно было основывать на подогреве винограда систему чистого брожения селекционированными культурами. Отмечено, что дрожжи вносятся даже воздухом бродильных цехов. На поверхности нагретой мезги в открытых чанах при самопроизвольном охлаждении быстро появляются дрожжи, тогда как температура еще равна 53°С.
После подсчета дрожжевых клеток чашки Петри использовали для отбора рас с целью их идентификации обычными тестами. Из подогревавшейся и еще теплой мезги выделяли единственную расу, которая оказалась Sacch. ellipsoideus. В охлажденной мезге снова появляются дрожжи, поступающие с оборудования или из воздуха. Hanseniaspora uvarum присутствует с начала брожения; в дальнейшем количество Saccharomyces постепенно возрастает.
Очень часто наблюдают быстрое и полное брожение даже при высокой температуре. В соответствии с предыдущими замечаниями этот факт не связан с селекцией термостойких дрожжей путем нагревания. В действительности быстрое брожение при высокой температуре обусловлено растворением в мезге активаторов, принадлежащих к категории стероидов и находящихся на поверхности или внутри кожицы. Осветленное нагретое сусло бродит в анаэробиозе не лучше, чем сусло без подогревания. И наоборот, нагретое сусло с семенами винограда бродит несколько быстрее, чем контрольное; но брожение нагретого сусла с кожицей претерпевает значительное ускорение, когда проводят брожение в анаэробиозе и особенно при повышенной температуре. Эти факты связаны с недавно полученными данными о роли стеринов и жирных ненасыщенных кислот с высокой молекулярной массой в анаэробном развитии дрожжей (Старр и Парке, 1962; Можене и Дюпюи, 1964; Шове и сотрудники, 1966). С другой стороны, Брешо и сотрудники (1966 и 1971) показали эффективность экстрактов виноградного пруина и в особенности олеаноловой кислоты, которая является его главным компонентом.
По мнению Сапи-Домерк и Пейно (1973), эти явления объясняют лучше, чем выдвигавшиеся до сих пор аргументы. Фактически термообработка вызывает растворение пруина в массе мезги. Действительно, прирост дрожжей и бактерий особенно возрастает, когда нагревают виноград в целом виде, а не только сок.
Эти новые гипотезы дополняют ранее выдвинутые предположения о роли азотистых соединений (Мартиньер, 1972 и 1973; Пу, 1974) или же вывод об образовании ацетальдегида при нагревании винограда (Мартиньер и Риберо-Гайон, 1973). Однако нужно отметить, что ацетальдегид также в значительной степени способствует росту молочнокислых бактерий. Следовало бы попытаться выяснить факторы, способные действовать в обоих случаях. Наконец, можно отметить, что добавление эргостерина в мезгу, лишенную доступа воздуха, не способствует брожению.
Эти же авторы (Сапи-Домерк и Пейно, 1973) проводили опыты, аналогичные с вышеописанными, но на установках, обеспечивающих нагревание целого винограда водяным паром. Таким путем доводили температуру кожицы до 70—80°С и температуру мякоти ягод до 35—40°С. Затем виноград охлаждали сильной вентиляцией. В отношении стерилизации винограда и быстрого обсеменения его дрожжами после нагревания результаты были в основном такие же.

Рис. 7.8. Изменение концентрации живых дрожжевых клеток во время брожения:
1 — виноград нагретый прессованный; 2— виноград нагретый непрессованный; 3 — контроль без нагрева.

Таблица 7.8
Число живых дрожжевых клеток при брожении мезги с нагреванием и без нагревания (в млн. на 1 см³)

Кордонье (1970), ссылаясь на Барра и проводя взвешивание дрожжей, сообщил, что нагревание мезги вело к возрастанию биопотенциала сусел. На рис. 7.8, который иллюстрирует результаты эксперимента Мартиньери и сотрудников (1973), показано также благоприятное влияние предварительного подогрева мезги на рост дрожжей.
Сразу же после нагревания, до проведения каких-либо других операций, число живых дрожжевых клеток практически равно нулю. Но обсеменение через оборудование протекает очень интенсивно, и соответственно этому быстро увеличивается число клеток.
В табл. 7.8 обобщены эти наблюдения.

Бактерии

Изменение числа живых бактерий, способных вызвать яблочно-молочное брожение, влияние последующих операций, затем брожение и хранение стали вопросами исследования, проведенного Мартиньери и сотрудниками (1972—1975). Результаты различаются по годам; возбуждение и протекание яблочно-молочного брожения также зависят от случайности, например наблюдали изменения, обобщенные в табл. 7.9 (относится к году с небольшим развитием бактерий).

Таблица 7.9
Число живых бактерий при брожении мезги с нагреванием и без нагревания (в млн. на 1 см³)

В процессе классического виноделия уменьшение числа бактерий во время брожения сопровождается возрастанием популяции в процессе прессования. При сбраживании сусла из подогретого винограда наблюдают значительное увеличение числа бактерий начиная с первого дня брожения. Бактерии быстро развиваются в начале брожения вследствие наличия питательной среды, которая очень благоприятна для размножения их, но очень скоро они сталкиваются с антагонистическим действием веществ, и прежде всего спирта, которые подавляют их дальнейшее развитие.
Был проведен сравнительный опыт по подсчету бактерий, в результате которого были получены следующие результаты. В классическом виноделии в момент загрузки чана число живых клеток на 1 см³ было довольно значительным (105) и в первые дни брожения оставалось также относительно значительным (107). В случае подогревания мезги с последующим стеканием сусла число живых бактерий на выходе из аппарата равнялось нулю, но при прессовании и наполнении чана суслом обеспечивалась достаточная концентрация (102), чтобы вызвать относительно интенсивное развитие микробиальной флоры (106). В результате в обоих случаях сброженное вино почти не имело больше живых бактерий, но проводимые операции вновь повышали концентрацию их (от 102 до 104). В этом опыте в обоих случаях яблочно-молочное брожение возбуждалось почти в одно и то же время.
В 1974 г., когда авторы получили в свое распоряжение полупромышленную установку для непрерывного подогрева сравнительно небольших объемов (6 гл), была сделана попытка выяснить (на партии тщательно усредненной мезги) влияние сульфитации (80 мг/л SO₂) и нагревания на рост молочнокислых бактерий (Мартиньер и сотрудники, 1974). В классическом виноделии (с сульфитированием и без него) и в виноделии с подогревом мезги (1 ч при 70°С) ход процессов очень аналогичен ходу процессов в описанном выше опыте 1973 г., за исключением того, что число живых бактерий в данный момент процесса было в 100 раз, а иногда и в 1000 раз меньше. Эта разница, безусловно, связана с тем, что 1974 г. был холодным, а в период последней фазы созревания и уборки шли сильные дожди. В начале спиртового брожения наблюдались рост, затем уменьшение числа бактерий параллельно с увеличением содержания спирта и, несомненно, с появлением антагонизма дрожжи — бактерии.
Все в тех же опытах 1974 г. при нагревании мезги число живых бактерий снижалось практически до нуля, но значительно повышалось в начале спиртового брожения до значений, лишь немного меньших, чем у контрольного образца, с несколько более поздним возбуждением яблочно-молочного брожения. Как и в 1973 г., после латентного периода (от нескольких дней до месяца) наблюдалось быстрое размножение бактериальных клеток, сопровождаемое через несколько дней снижением общей кислотности бродящей массы. Несмотря на сульфитирование (50 мг/л SO₂) (с нагреванием или без него), ход процессов в этом опыте заметно не изменился по сравнению с контрольным брожением.
Нужно отметить, что в другом опыте вино, полученное из винограда, сульфитированного 80 мг/л SO₂ и подвергнутого нагреванию, не претерпело яблочно-молочного брожения до зимы в противоположность контрольному образцу, приготовленному классическим способом (Мартиньер и сотрудники, 1975). Во всех подвалах, где находились эти бочки, до конца ноября поддерживалась температура 17°С. С другой стороны, в винах из подогретой мезги независимо от яблочно-молочного брожения содержание винной кислоты и общая кислотность остаются обычно несколько более высокими, чем в контрольных образцах классического виноделия, возможно, вследствие присутствия коллоидов в повышенных концентрациях.

Образование ацетальдегида

Экспериментаторы чаще всего констатировали быстрое забраживание подогретой мезги, быстрое и полное сбраживание гексоз, более высокую спиртуозность получаемого вина (на несколько десятых градуса), более низкие значения летучей кислотности и общего азота в конце брожения, равномерное понижение титруемой кислотности с самого начала брожения (без обычного подъема в первые дни).
Была сформулирована гипотеза (Мартиньер и Риберо-Гайон, 1969),что скорость брожения связана с образованием уксусного альдегида или этаналя при нагревании винограда. Было прослежено изменение ацетальдегида во время брожения нагретой мезги с последующим обсеменением и такой же мезги без подогрева. С началом брожения содержание ацетальдегида в нагретом винограде достигает 40— 60 мг/л вместо нуля в контрольном образце. Максимум (например, 80 мг/л) достигается быстрее, чем в контроле (например, через 2,5—3 дня вместо 4—6 дней). Затем уменьшение содержания ацетальдегида происходит быстрее в нагретом винограде. Этот факт может быть причиной более быстрого начала брожения, поскольку обычно ацетальдегид — непосредственный предшественник спирта — должен быть сначала образован из сахара в период индукции, соответствующей глицерино-пировиноградному брожению.
Содержание ацетальдегида, образовавшегося при нагревании, когда его проводят в открытом чане, снабженном мешалкой, остается довольно небольшим. Это вещество обладает очень высокой летучестью (точка кипения 20,6°С), оно частично теряется во время нагревания, что подтверждает убывающее содержание, начиная с 40°С (табл. 7.10). Во избежание потерь в результате испарения эксперимент проводили в круглодонной колбе, нагретой на водяной бане и подключенной к обратному холодильнику. Пробы отбирали при различных температурах. Полученные результаты приведены в табл. 7.10.

Таблица 7.10
Зависимость содержания ацетальдегида (в мг/л) от температуры нагревания винограда

Следовательно, при нагревании красного дробленого или прессованного винограда образуются значительные количества ацетальдегида. Этот эксперимент также показывает, что при простом дроблении винограда такого образования ацетальдегида не происходит.
Источником ацетальдегида может быть реакция Майяра, наиболее явным проявлением которой является побурение, вызываемое нагреванием растворов восстанавливающих сахаров и аминокислот. Реакции протекают в очень сложной последовательности: образование продукта присоединения, дегидратация и изомеризация, ведущие к 1-амино-1-деокси-2-кетозе. Это вещество вследствие потери двух молекул воды дает дикетон (редуктон), который после дегидрирования дает дегидроредуктон и вступает в реакцию с новой молекулой аминокислоты, чтобы образовать продукт присоединения, альдегид и углекислый газ. Если, например, исходной аминокислотой будет аланин, цепь реакций завершается ацетальдегидом.
В 1974 г. добавление ацетальдегида (150 мг/л) в чан вместимостью 6 гл не вызвало ускорения начала брожения по сравнению с брожением в контрольном чане (в обоих случаях классическое виноделие), но повысило скорость брожения: через 7 дней плотность сусла составляла 1006 вместо 1012. Отсутствие влияния на забраживание объясняется, несомненно, необычно низкой температурой во время сбора урожая в 1974 г. (в среднем 12°С).
Таким образом, ацетальдегид, присутствующий в среде сначала брожения, образует спирт непосредственно, без прохождения фазы классической индукции. Эксперименты с красным виноградом, которые провел Сюдро, показали, что в случае нагревания винограда и переработки его по белому способу, содержание уксусной кислоты всегда меньше. Это же самое можно было констатировать и для 2,3-бутандиола (табл. 7.11).

Таблица 7.11
Вторичные продукты, образующиеся во время спиртового брожения мезги