Явления ингибирования дрожжей - Вещества, ингибирующие дрожжи

Известно много категорий продуктов, оказывающих ингибирующее действие на микроорганизмы:

1. наркотики — вещества, обычно растворимые в маслах, которые блокируют все функции клеток, но действие их является обратимым. После их удаления клетки восстанавливают свою активность. Это карбиды, высшие спирты, простые или галогенные;
2. антисептики, способные убивать клетки. К этой группе, особенно распространенной и разнообразной, относятся бензойная и салициловая кислоты и их производные, фториды, сернистая кислота в больших дозах н при низком рН, аллилизотиоцианат и др.;
3. специфические ингибиторы брожения, способные блокировать спиртовое и молочнокислое брожение клетки, однако без прекращения ее дыхания и роста, по крайней мере, в узкой зоне концентраций. Это а-галогенные кислоты, такие, как монобромуксусная. При повышенных дозах или в кислых средах эти вещества входят в категорию обычных антисептиков;
4. некоторые поверхностно-активные ионизирующие вещества с сильной смачивающей и пенообразующей способностью, например четвертичные соли аммония;
5. антивитамины — вещества, близкие по своему химическому составу к некоторым факторам роста; они блокируют метаболизм и вызывают гибель клетки. Это вещества, аналогичные сульфамидам, антивитаминам парааминобензойной кислоты;
6. фунгициды — химические вещества, образующиеся чаще всего путем синтеза и действующие против плесеней, грибов и дрожжей. Эти продукты находят практическое применение в садоводстве и виноградарстве в качестве пестицидов (действуют на милдью винограда, на Botrytis cinerea);  
7. антибиотики — вещества, образуемые плесневыми грибками, актиномицетами или бактериями, которые оказываются способными ингибировать рост других микроорганизмов или даже разрушать их, тогда как большая часть перечисленных продуктов действует в большей пли меньшей степени на все микроорганизмы. Антибиотики по своему ингибирующему воздействию являются очень специфичными, например некоторые активны только против отдельных категорий бактерий, другие же действуют только на определенные виды дрожжей.
   Дрожжевые клетки относительно устойчивы к различным антисептическим агентам. Они имеют сравнительно большие размеры и толстую мембрану. Такие клетки противопоставляют среде своего обитания определенную клеточную автономию. Бактерии же значительно более уязвимы. Например, если для ингибирования бактерий достаточно нескольких миллиграммов свободной сернистой кислоты, то для дрожжей в этом случае ее требуется в 10 раз больше.
   Ингибирующие продукты очень различны по своему химическому составу и механизму действия. Они парализуют ту или другую клеточную функцию, действуя против одного или многих ферментов и блокируя таким образом жизнедеятельность клеток. Некоторые из них убивают дрожжи; говорят, что они обладают фунгицидным действием. Другие парализуют только рост и затрудняют распускание почек; их называют фунгистатическими. Один и тот же продукт может быть фунгистатическим при слабой дозе и фунгицидным при сильных дозах. Таким же образом различают продукты бактерицидные и бактериостатические в зависимости от их действия на бактерии.
   Разумеется, что применение этих продуктов для консервации вина категорически запрещено, за исключением сернистого ангидрида и с-орбиновой кислоты, разрешенной во Франции с 1959 г. для использования в ограниченных дозах. Известны преимущества и эффективность сернистого ангидрида для предотвращения микробиальной порчи красных вин и дображивания сладких вин. Известны также и неудобства его применения в завышенных дозах, поэтому понятна необходимость изыскания других продуктов, которые могли бы заменить сернистый ангидрид, хотя, конечно, можно совершенствовать и дальше способы его применения. Однако для того чтобы получить право на технологическое использование с обеспечением достаточной эффективности, такие продукты должны отвечать требованиям в первую очередь абсолютного отсутствия токсичности, затем нейтральности в отношении органолептических характеристик и, наконец, стабильности. Именно в результате исследований такого рода было разрешено использование сорбиновой кислоты.
   В намерения авторов не входит исчерпывающее исследование различных продуктов, способных ингибировать дрожжи. Перечень основных препаратов дан в соответствующих таблицах предыдущего издания (т. 1). С тех пор появилось много нового. Активные дозы зависят от многих факторов, они различны в суслах и в винах и в отношении их дозы во многом зависят от степени спиртуозности, фактической кислотности, содержания усвояемого азота и т. д.
   Авторы рекомендуют основные публикации по этому вопросу: Риберо- Гайон и сотрудники, 1952, 1958; Риберо-Гайон и Пейно, 1952; Пейно, 1952; Пейно и С. Лафуркад, 1953; Пейно и сотрудники, 1957; С. Лафуркад, 1955.
   Имеется большое количество работ по продуктам-консервантам, в том числе: Шормюллер, 1959; Рем, 1959, 1960, 1961.
   Химические антисептики
   Ниже перечислены химические антисептики и антибиотики, которые строго запрещается добавлять в напитки (за исключением сорбиновой кислоты, допускаемой в винах в концентрации, не превышающей 200 мг/л).
   Бензойная, параоксибензойная, борная кислота и бораты — активная доза для сусла 1000 мг/л, для вина — от 200 до 500 мг/л.
   Парахлорбензойная кислота и ее соли — слабый фунгицид; активные дозы для вина от 20 до 50 мг/л.
   Дигидроуксусная кислота — фунгистатична; активные дозы для вина от 100 до 200 мг/л.
   Фтористоводородная (плавиковая) кислота и ее соли (20 мг/л) замедляют брожение сусла и удваивают его продолжительность; дозы консервации вина от 30 до 50 мг/л.
   Монобромуксусная кислота, монохлоруксусная кислота, их соли и сложные эфиры. Ядовиты для метаболизма; активные дозы для сусла от 20 до 30 мг/л, для вина — от 2 до 10 мг/л.
   Салициловая кислота и ее соли — малоактивна; активные дозы для сусла от 500 до 1000 мг/л; для вина — от 200 до 500 мг/л.
   Сорбиновая кислота — фунгистатична, блокирует бродильную функцию. Активные дозы для сусла от 500 до 1000 мг/л; для вина — от 100 до 200 мг/л.
   Гераниевая кислота — оказывает фунгистатическое и бактериостатическое действие в тех же дозах, как и сорбиновая кислота.
   Соли четвертичного аммония — продукт для очистки винодельческих емкостей.
   Серебро (металлическое, ионизированное или коллоидное) —  фунгицид, продолжительность действия ограничена; брожению не мешает, уменьшает сбраживаемость сусел и вин.
   Каптан — фунгицид. В дозах от 30 до 50 мг/л останавливает брожение. Дозы консервации вина от 5 до 10 мг/л; малостабильный продукт.
   Этиловый эфир хлоругольной кислоты (Матта, 1963) — неустойчивый фунгицид.
   Октилгаллат (Лонжен, 1967) — фунгистатичного действия. Активные дозы для сусла 50 мг/л; для вина — 10 мг/л.
   Аллилизотиоцианат (эссенция горчицы) — фунгистатичный, без воздействия на метаболизм; не может остановить дображивание, но препятствует его началу. Активные дозы для сусла 10 мг/л; для вина — 2 мг/л.
   5-нитрофурилакриловая кислота — активные дозы для сусла от 20 до 100 мг/л, для вина — 5 мг/л (С. Лафон-Лафуркад, 1974).
   Нитрид натрия —1 блокирует метаболизм дрожжей. Опасный протоплазменный яд. Активные дозы для сусла от 5 до 10 1мг, для вина — от 1 до 2 мг/л.
   Этилпирокарбонат -- фунгицид, химический стерилизант. Активные дозы для вина 100 мг/л.

Противогрибковые антибиотики

Актидион (циклогексимид) — фунгистатический; действует только на рост. Активные дозы для сусла 10 мг/л, для вина—от 0,2 до 0,5 мг/л. Некоторые виды дрожжей выдерживают до 100 мг/л.           
Амфотерицин  — фунгистатический; активные дозы для сусла>20\г/л; для вина — от 0,5 до 5 мг/л.                                            
Антимицин А — фунгистатический; активные дозы для сусла>50 мг/л Для вина — 0,5 мг/л. 
Кандицидин — фунгистатический  активные дозы для сусла 20 мг/л, для - вина — 7 мг/л.
Фреквентин — фунгицид; останавливает брожение при дозе 20 мг/л.
Фунгихромин —  фунгицид; активные дозы для сусла 5 мг/л, нестабилен в вине.
Микостатин — фунгицид; стерилизует среду или останавливает брожение при дозе 25 мг/л, нестабилен.
Микосубтилин — фунгистатический; активные дозы для сусла и для вина от 2 до 10 мг/л.
Патулин — малоактивен; был идентифицирован в винограде, пораженном зеленой гнилью.
Плеоцидин — фунгистатический; активные дозы для вина от 2 до 20 мг/л.
Трихомицин — фунгицид, менее активный, чем микостатин; дозы, необходимые для сусла и вина, 50 мг/л.
Виридин — фунгицид; активные дозы для сусла и вина от 10 до 20 мг/л.

Одно из направлений этих исследований получило особое развитие, а именно относительно влияния пестицидов на микрофлору винограда и на брожение мезги. Под пестицидом понимают такой химический продукт, который отдельно или в смеси с другими веществами используют как инсектицид, фунгицид, гербицид и т. д. для борьбы с вредителями растений и урожая. В случае винограда, пестициды, используемые против мильдью, черной плесени, серой плесени, являются фунгицидами.
Можно было бы привести много работ, опубликованных во Франции и в других странах в области исследования последствий обработок виноградных насаждений на брожение. К числу их относятся труды: Минарик и Рагала, 1966; Гуртер и сотрудников, 1966; Эренхардт и Якоб, 1968; Лемперле и сотрудников, 1971; Белин и сотрудников, 1971; Касиньяр, 1972.
Ниже сравнивается задерживающее действие основных продуктов обработок, добавляемых из расчета 10 мг/л в виноградное сусло, обсемененное дрожжами.

Фунгициды, содержащие серу или хлор, обладают наиболее сильно выраженными противодрожжевыми свойствами; это каптан, фальтан и дифолатан, в особенности последний. Дихлорфлюанид также имеет довольно выраженные фунгицидные и фунгистатические свойства. На практике нередко констатировали задержку брожения сусел из винограда, обработанного за несколько дней до уборки. Достаточное обсеменение дрожжами позволяет преодолеть этот недостаток, но трудности с завершением брожения можно приписать присутствию этого препарата для борьбы с плесенью. С другой стороны, дитиокарбаматы действуют на дрожжи только при повышенных дозах, порядка 0,5 г/л, и, следовательно, значительно выше концентраций, применяемых в винодельческом производстве.
Гераниевая кислота
является ингибирующим продуктом, явно более многосторонним, чем сорбиновая кислота. При дозах, близких к 200 мг/л, она оказывает заметное действие на пленчатые дрожжи, а также на бактерии уксуснокислого и молочнокислого брожения. Но при этой дозе продукт приобретает запах и вкус, несвойственные вину.

Механизм действия ингибиторов на метаболизм дрожжей

Эффект действия ингибиторов на интенсивность дыхания (Qo) и на интенсивность брожения одной из рас Sacch. ellipsoideus был определен посредством манометрического аппарата Варбурга. Измерения проводили в фосфатном буфере с рН 3,8. Оперировали только с известной сухой массой молодых клеток, культивированных на жидкой синтетической среде и выделенных центрифугированием после 48 ч роста, затем промытых и помещенных в воду в виде суспензии. Интенсивность дыхания определяли при 25° С на молочной кислоте, а интенсивность брожения — на глюкозе в условиях анаэробиоза, полученного длительным продуванием углекислым газом.
В табл. 9.3 приведены значения газообмена в опытах с различными продуктами.
Из табл. 9.3 видно, что доза микостатина 5 мг/л ингибирует 80% дыхания дрожжей и полностью останавливает брожение. Его активность во многом зависит от рН; этот антибиотик в 2 раза более активен при рН 3,8, чем при рН 4,8, и в 10 раз более активен при рН 3,8, чем при рН 7,0. Многие вещества вызывают ингибирование такого же типа, как и микостатин.
В предшествующем издании этого труда описано в качестве примера детальное исследование механизма антигрибкового действия микостатина.

Влияние различных веществ на интенсивность дыхания и брожения у Sacch. ellipsoideus (в мм³ газа на 1 мг сухих дрожжей за 1 ч)

Этот антибиотик оказался очень активным фунгицидом, способным убивать дрожжи, но весьма нестабильным. Это один из редких антибиотиков, обеспечивающий остановку спиртового брожения при дозе 25 мг/л. Дозы от 10 до 15 мг практически стерилизуют среды с 10% спирта. В дальнейшем микостатин теряет 'большую часть своей активности; через 2 нед он уже не обнаруживается, так как представляет собой стерилизующий продукт, который, произведя свое действие, исчезает. Эти данные подтвердил Гарольо (1960).
При 100 мг/л анионы сульфитов блокируют дыхание независимо от рН. С другой стороны, известно, что их действие на брожение подчинено рН. При рН 3,8 интенсивность брожения снижается после добавления 100 мг/л на 40%, после введения 200 мг/л — на 50% и при 500 мг/л — на 90%, следовательно, сульфиты активно действуют на дыхание дрожжей, но только сернистый ангидрид подавляет  брожение. К тому же его действие не является мгновенным; при добавлении 200 мг/л в бродящую среду дрожжи продолжают сбраживать еще немного сахара в течение первого часа после, введения сернистого ангидрида.       
Каптан оказывает меньшее действие на респираторную функцию; его действие на брожение возрастает постепенно и так же прекращается; брожение продолжается еще в течение 1 ч после добавления препарата.
При низком рН монобромуксусная кислота ведет себя в отношении метаболизма как яд общего действия, скорее понижающий уровень дыхания, чем интенсивность брожения. Значительное расхождение между фунгистатической и фунгидидной дозами наводит на мысль, что монобромуксусная кислота оказывает сильное действие на размножение дрожжей.
Парахлорбензоат натрия производит слабое фунгицидное действие даже при сильных дозах. 200 мг/л препарата практически прекращают дыхание, но еще сохраняется примерно 50% бродильной активности.
Наконец, еще одна группа состоит из продуктов только фунгистатического действия, которые ингибируют размножение дрожжей и практически не участвуют в процессах метаболизма; таковы, например, актидион и аллилизотиоцианат. Тогда как 0,2 мг/л актидиона тормозят размножение, 100 мг/л оказывают лишь слабое воздействие на дыхание и брожение Sacch. ellipsoideus. Аллилизотиоцианат даже в значительных дозах, порядка 50 мг/л, также не затрагивает бродильную функцию клетки.
Обстоятельную работу по активности актидиона в отношении Sacch. ellipsoideus выполнил Монреаль (1961). Пейно и сотрудники (1962) показали, что несколько редких рас Saccharomyces обладают очень высокой устойчивостью и даже полной невосприимчивостью к актидиону. Эти авторы исследовали действие нового антибиотика, стрептимидона, химическая - формула которого имеет определенное сходство со структурой актидиона. Оба антибиотика имеют одинаковое ядро имида глутаровой кислоты. Антидрожжевой спектр стрептимидона довольно близок к спектру актидиона. Расы Saccharomyces, устойчивые к актидиону, устойчивы также и к стрептимиону.
Различные противогрибковые вещества резко отличаются одно от другого особенностями действия, своей специфичностью в отношении дрожжей, условиями и дозами, при которых они активны, своей стабильностью. Их можно подразделить на две категории: фунгистатические ингибиторы, такие, как сорбиновая кислота и актидион, не действующие на уже начавшееся брожение, но имеющие стабильные и хорошие консервирующие свойства, и фунгициды, представленные этилпирокарбонатом и микостатином, — стерилизанты мгновенного действия, но не обладающие стабильностью, оба последних продукта вызывают подлинную стерилизацию на холоде.
Антибиотики являются мощными ингибиторами дрожжей, но противодрожжевой спектр каждого из них ограничен отдельными видами. Иногда некоторые расы могут оказаться вне воздействия того или иного из этих, продуктов. Антисептики химического происхождения имеют более широкий спектр фунгицидного действия.