УДК 631.1:631.524.85.
БИОТЕХНОЛОГИЯ ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МУТАНТОВ СМОРОДИНЫ
В Д. Лукин
ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, г. Мичуринск
Изучение мутантов является одним из путей изучения генетики признаков и получения новых морфологических типов. Изучены пути использования мутантов в селекции новых форм садовых растений. Особое внимание уделено использованию способных к реверсиям генным мутантам, которые позволяют получать генотипы с широким спектром экспрессии признаков опытных растений.
В тридцатых годах 19 в. Н. Бор писал о возможности использования принципов атомной физики при анализе элементарных биологических структур и явлений. Сущность идеи состоит в том, что в области элементарных биологических явлений можно встретиться с тем же дуалитетом, как и в квантовой физике. Принцип дуалитета указывает на максимум того, что можно установить на изучаемом объекте в случае неприменимости классических методов.
Например, невозможно предсказать в каком из одинаковых макроиндивидуумов возникнет мутация, которая послужит исходным микробиологическим явлением для целой цепи макробиологических процессов в онтогенезе исходной формы. Иными словами при взаимодействии ионизирующих частиц с генами нельзя точно и однозначно предсказать, произойдет ли мутация в определенном гене после соответствующего облучения. В результате энергетического действия ген может переходить из одной относительно стабильной молекулярной структуры в другую. При этом одни признаки могут заменяться другими. Мутации дискретны, поскольку получается конечное число наследственных вариаций. Это указывает на то, что различия аллелей определяют состояния образующих молекул. Поскольку число возможных структурных изменений определенной молекулы конечно и ограничено, то таковым должно быть и число аллелей. Практически число аллелей всегда меньше из-за ограничения вариационных возможностей летальным эффектом и потери способности к конвариактной редупликации. Часто наблюдаемая непрерывная изменчивость признаков связана с модифицирующим влиянием среды. Наличие дискретных групп среди живых организмов является отражением квантовой природы структуры вещества.
Таким образом, сущность мутационного процесса состоит в переходе генетической информации от одного квантового состояния к другому. Квантовая неопределенность возрастает с увеличением дозы облучения, когда кривая доза - эффект имеет не экспоненциальную, а сигмоидную форму, которая модифицируется многими факторами и не поддается однозначной интерпретации с позиций теории мишени.
Мнение о предпочтительности критических и сублетальных доз основано на следующем: высокие дозы мутагена дают больше мутаций, поэтому для их выделения нужно проанализировать меньше материала. Главным возражением против высоких доз является то обстоятельство, что высокие дозы часто вызывают появление нескольких мутаций в одной и той же клетке. Против этого можно выдвинуть следующие возражения. Итоговая частота мутаций существенно не повышается, а иногда и снижается. Наличие одинаковых мутаций в клетках маловероятно, поэтому сохранение или потеря какой-либо конкретной мутации мало зависит от общей частоты мутаций и от дозы мутагена. Там, где в максимальной степени нужно сохранить генотипическую специфику исходной формы, оптимальная доза облучения должна быть в 2-3 раза ниже критической.
На Международном симпозиуме 1977 г. по экспериментальному мутагенезу была принята классификация мутаций, по которой все типы мутаций могут быть разделены на три главные категории.
- Геномные мутации (полиплоидия, анеуплоидия).
- Хромосомные мутации: структурные перестройки (транслокации, инверсии, дупликации, нехватки или делении), генные мутации (субмикроскопические изменения внутри первичной структуры генного локуса).
- Внеядерные мутации (мутации плазмид и митохондрий).
Генные мутации делят на два больших класса. К первому классу
относят те из них, которые связаны с заменой оснований. Мутации второго класса обусловлены сдвигом рамки считывания. Последние включают в себя вставки или делеции одной или нескольких нуклеотидных пар. Замена оснований составляет не более 20 % мутаций, большинство остальных мутаций происходит в результате делеции и вставок.
Существуют два типа замен нуклеотидов - транзиции и трансверсии. Транзиции заключаются в замене одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин. Радиация индуцирует этот тип замены в 30 % случаев. При трансверсии пурин меняется на пиримидин или наоборот. Для определения генных мутаций используются следующие критерии: отсутствие цитологических нарушений; расщепление гетерозигот нормальное, чаще всего моногибридное; способность к реверсии. Следует отметить, что реверсии всегда были критерием отсутствия нехваток по данному гену. Однако сейчас хорошо известно, что фенотипический эффект, подобный об- ратной мутации, может вызываться появлением супрессорных мутаций в других локусах.
Плейотропия - серьезное препятствие для использования мутантов в практической селекции. Мутант, у которого изменено много признаков и только один или два признака имеют селекционное значение, а остальные - нежелательны, нельзя прямо использовать в качестве родоначальника нового сорта. Такие мутанты целесообразно использовать в скрещиваниях с другими сортами и формами. В другой генотипической среде отдельные признаки плейотропного комплекса могут менять свое выражение. Нередко отрицательные признаки ослабевают. Фенотипическое выражение, то есть экспрессивность мутантного гена может изменяться в зависимости от экологических условий. Это обусловлено тем, что мутанты представляют собой новые генотипы по сравнению с исходными формами и отличаются от последних не только морфологическими признаками, но и нормой реакции на условия внешней среды.
Изучение влияния на развитие организма разных типов мутаций в гомо- и гетерозиготном состоянии связано с моногибридным гетерозисом (эффект сверхдоминирования). Теория сверхдоминирования основана на межаллельной комплементации. Изменение окраски листьев у мутантов связано не только с нарушениями в биосинтезе пигментов, но и с изменениями биосинтеза аминокислот, витаминов, электронтранспортной цепи фотосинтеза, белково-липидного комплекса.
Важной чертой индуцированных мутаций у растений является рецессивный характер наследования. Об этом свидетельствуют работы, выполненные на разных культурах. Доминантные и полудоминантные мутации у растений возникают значительно реже. Случаи появления доминантных мутаций описаны в немногих работах. Доминантные и полудоминантные мутации более часто возникают у полиплоидов и реже у диплоидов.
Мутации появляются в отдельных клетках, но для того чтобы их можно было выявить, изменения должны затронуть по меньшей мере целый побег. Необходимо чтобы из мутантной клетки появилась ткань, из которой будет затем построен побег. Рост тканей наиболее интенсивно происходит из облученных почек, которые меньше повреждены, а мутантные ткани вследствие их медленного роста занимают лишь какой-то сектор или сегмент побега. Конечной задачей является получение побега, целиком состоящего из мутировавших клеток.
Принцип работы с выяснением мутации заключается в том, чтобы вызвать к росту как можно больше число придаточных или спящих почек. С этой целью у плодовых культур производят декапитацию побегов, то есть срезают верхушку побега. Эта операция приводит к развитию этих почек и росту боковых побегов. Отбор начинают вести уже среди этих побегов. Особенно часто несут мутацию нижние побеги. Однако чаще всего для выяснения мутации необходимо несколько раз последовательно производить указанную выше операцию. Побеги режут на черенки, укореняют или прививают в крону дерева, затем декапитируют, вызывая рост побегов боковых побегов, которые опять черенкуют.
Получение соматических мутаций у плодовых культур имеет особенно большой практический интерес, так как они имеют сложную генетическую природу и высокую степень гетерозиготности. Только облучение в данном случае дает возможность изменить лишь один признак, не затрагивая остальных признаков сорта. В настоящее время в области экспериментального мутагенеза наметились два основных направления работ:
- теоретическое, связанное с выявлением закономерностей мутационной изменчивости на хромосомном, клеточном и организменном уровнях;
- прикладное, заключающееся в разработке методов мутант- ной селекции и создании новых форм растений.
Согласно современным представлениям генные мутации - это изменения на уровне нуклеотидов ДНК, не затрагивающие белковый компонент нуклеопротеида и не нарушающие в процессе своего формирования целостности хромосомы. Индуцированные облучением генные мутации формируются в более короткий промежуток времени и в меньшей степени зависят от различных внутриклеточных процессов, в том числе и репарационных, чем хромосомные перестройки. Известно, что радиационный микромутагенез у высших эукариот
инициируется первичными повреждениями димеров, содержащих цитозин, в основном в области уникальных последовательностей оснований ДНК. У настоящих возвратных мутантов полностью восстанавливаются ферментативные свойства исходного гена, обусловленного тем, что у них исправлены изменения строения ДНК. Мутации, у которых ферментативные свойства полностью восстанавливаются, а строение ДНК гена остается измененным, называются супрессорными мутациями. Существуют два класса супрессорных мутаций: прямые внутригенные и непрямые внегенные, механизм действия которых совершенно различен.
При прямых внутригенных супрессорных мутациях повреждение ДНК, вызванное первичной мутацией, остается неисправленным, но возникают вторичные изменения ДНК, которые почти или полностью восстанавливают ферментативные свойства того белка, синтез которого контролирует этот ген. При непрямых внегенных супрессорных мутациях супрессорная мутация происходит не в том гене, в котором происходит первичная мутация, а совсем в другом, и повреждение, вызванное первичной мутацией, не исправляется, а обходится. Этот обход осуществляется обычно на уровне белков-ферментов путем увеличения количества или повышения активности тех белков- ферментов, с которыми взаимодействует тот белок-фермент, синтез которого нарушен первичной мутацией.
Мутантный генофонд - это материальная база для развития как теоретических исследований, так и практической селекции растений. Генные мутации создают огромную наследственную изменчивость хозяйственно-полезных и биологических признаков (продуктивность, содержание питательных веществ, устойчивость к неблагоприятным условиям). Многие мутанты представляют собой источники ценных генов, контролирующих важные признаки. Использование в селекции уникальных мутантных форм позволит перейти к созданию новых морфобиологических типов.
Возможны два основных пути селекционного использования искусственных мутаций: прямое использование и использование мутаций в процессе гибридизации. В первом случае ставится задача улучшения существующих сортов по некоторым признакам. Метод прямого использования мутаций рассчитан на быстрое создание исходного материала с нужными признаками и свойствами. Однако прямое и быстрое использование мутаций при тех высоких требованиях, которые предъявляются к современным сортам, не всегда дает положительные результаты. Полученный вследствие мутагенеза исходный материал должен, как правило, пройти через гибридизацию - это второй путь использования искусственных мутаций. Мутации могут изменить свое фенотипическое выражение в зависимости от того, в какой генотип они включаются. Особенно это относится к генным мутациям. Поэтому скрещивание качественно меняет влияние отдельных мутаций на развитие многих признаков и свойств.
Экспериментальный мутагенез используется также совместно с отдаленной гибридизацией. Путем искусственных мутаций в ряде случаев удается преодолеть нескрещиваемость разных далеких видов растений, а также производить пересадку путем транслокации отдельных локусов хромосом диких видов в хромосомный комплекс культурных растений. При воздействии радиации можно сравнительно быстро получить изменение таких признаков, которые трудно поддаются модифицированию.
Важнейшая проблема современной генетики - это создание генотипов, устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды, с высокой урожайностью и качеством продукции. Известно, что устойчивость, как правило, связана с доминантными признаками, а количество и качество продукции - с рецессивными. Однако совмещение таких доминантных признаков и рецессивных в одном сорте представляет сложную задачу, требующую использования в селекционном процессе большого количества растений. Отбор мутантов, индуцирование ревертантов и проведение генетического анализа признаков у них - это только начало работы по разработке методов получения новых форм растений.
Оценку мутагенной активности внешней среды проще проводить с помощью многолетнего растительного биоиндикатора. Он получен путем облучения черенков экологически устойчивого вида смородины американской критическими дозами гамма-облучения и последующего клонового отбора генотипов, чувствительных к наличию мутагенов в окружающей среде. Биоиндикатор можно использовать в лабораторных условиях для оценки мутагенного действия физических факторов и химических веществ; в городах, поселках и приусадебных участках в качестве декоративного кустарника и индикатора наличия мутагенов в окружающей среды по тесту обратных мутаций (появлению побегов с крупными листьями); в сельской местности в качестве средоулучшающей культуры, устраняющей водную и ветровую эрозию почв, вокруг интенсивно обрабатываемых земель. Преимуществом предлагаемого биоиндикатора является возможность проведения многолетнего мониторинга, не модифицированного временными случайными колебаниями уровня недифференцированных мутагенов среды.
