Использование биотехнологических методов для повышения эффективности отдаленной межродовой гибридизации семечковых плодовых культур

УДК:  634.11/13: 631.527.5 (087)
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОТДАЛЕННОЙ МЕЖРОДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ СЕМЕЧКОВЫХ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР
Р.В. Папихин, С.А. Муратова ГНУ Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, г. Мичуринск
Показана перспективность применения эмбриокультуры для повышения эффективности отдаленной гибридизации. Определены оптимальные концентрации регуляторов роста на этапах введения зародышей и микроразмножения полученных проростков. Получены положительные результаты регенерации адвентивных побегов из участков семядоли и каллуса непроросших зародышей. Определены условия укоренения и адаптации гибридных растений. Оценено влияние генотипа растений на каждом этапе культивирования.
Для создания новых хозяйственно ценных гибридов и сортов, отличающихся повышенной зимостойкостью и устойчивостью к болезням, все чаще используется отдаленная гибридизация растений. Основной проблемой при отдаленной гибридизации является генетическая несовместимость представителей разных таксонов, отдаленных в филогенетическом отношении. Исследования авторов, занимавшихся межвидовыми и межродовыми скрещиваниями различных сельскохозяйственных культур, свидетельствуют о многочисленных нарушениях в процессах оплодотворения и эмбрионального развития [1; 2; 3]. Как показывает практика селекционных работ, в результате отдаленной гибридизации часто формируются неполноценные и непрорастающие в обычных условиях семена.
Одним из перспективных методов для преодоления постгамной несовместимости является эмбриокультура. С применением этого метода отечественными авторами проведено значительное число работ по созданию межвидовых и межродовых гибридов плодовых и ягодных растений [3; 4; 5; 6].
В наших исследованиях сочетание методов отдаленной гибридизации и культуры in vitro позволило получить отдаленные гибриды семечковых культур, что не удавалось сделать в естественных условиях.
В культуру in vitro вводили гибридные зародыши, полученные при отдаленных скрещиваниях семечковых растений в комбинациях: груша Память Яковлева х яблоня Дискавери, груша Память Яковлева х яблоня А1, груша Северянка х яблоня Дискавери, яблоня А1 х груша Северянка, яблоня Богатырь х груша Августовская роса, яблоня Богатырь х груша Бере зимняя Мичурина, яблоня Антоновка х груша Бере зимняя Мичурина (БЗМ), яблоня 11-7 х груша Скороспелка, яблоня 11-7 груша Августовская роса, яблоня Пепин шафранный х айва Рулго.
Гибридные семена выделяли из плодов. С семян аккуратно снимали оболочки и извлекали зародыши. Извлеченные зародыши вместе с семядолями стерилизовали 0,1 % раствором сулемы в тече- ние 1 мин. с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой и высаживали в пробирки на искусственную питательную среду.
Для культивирования гибридных зародышей использовали минеральную основу питательных сред Мурасиге-Скуга [5] и Кворина- Лепорье [6], дополненную мезоинозитолом - 100 мт/л, гидролизатом казеина - 100 мг/л, сахарозой - 30 г/л, агаром - 6-7 г/л. рН питательной среды 5,6-5,8. На этапах введения и микроразмножения полученных проростков использовали регуляторы роста растений: 6- бензиламинопурин (6-БАП) - 1 -2 мг/л, гибберелловую кислоту (ГК) - 0,2 - 1 мг/л, р - индолил - 3 - масляную кислоту (ИМК) - 0,1-0,2 мг/л или р - индолилуксусную кислоту (ИУК) - 0,2-0,5 мг/л. На этапе укоренения микрочеренков концентрацию макросолей и сахарозы снижали вдвое. В качестве индуктора ризогенеза применяли ИМК в концентрации 0,5-1 мг/л.
Экспланты культивировали при температуре воздуха 26±2 °С, освещенности 2000-2500 люкс и фотопериоде 16/8 часов.
Для индукции морфогенеза из изолированных семядолей использовали 6-БАП в сочетании с одним из ауксинов. В среды регенерации добавляли 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), а - нафгилуксусную кислоту (НУК), ИМК или ИУК, соотношение цитокинин : ауксин - 10 : 1. Предварительно каждую семядолю разрезали поперечно центральной жилке на 3 части.
, Экспланты на средах регенерации культивировали в темноте или при освещении рассеянным светом низкой интенсивности (300- 500 люкс), при температуре 24 °С. Эксперименты по регенерации продолжались в течение 8-12 недель (2-3 пассажа по 3-4 недели каждый). Регенерировавшие побеги срезали с семядолей и доращивали по стандартной схеме клонального микроразмножения.
После посадки на питательную среду зародыши обычно переносят в условия пониженных температур (3-5 °С) на несколько месяцев и лишь затем культивируют при температуре 24-26 °С. Мы отказались от этапа выдерживания гибридных зародышей при пониженной температуре, что позволило значительно сократить сроки получения гибридных проростков. Через 2 месяца после введения зародышей в культуру in vitro удалось получить проростки практически во всех комбинациях (табл. 1).
Таблица 1
Развитие межродовых гибридных зародышей на искусственной питательной среде

Развитие зародышей учитывали по следующей 6-ти балльной шкале: 0 - отсутствие роста; 1 - позеленение семядольных листочков; 2 - образование первой пары листьев; 3 - образование розетки листьев; 4 - образование побега до 1,5 см; 5 - образование корней и побега более 1,5 см.
Как видно из таблицы 1, в большинстве комбинаций одновременно с непроросшими зародышами можно наблюдать хорошо развитые побеги с корнями.
Все полученные проростки были высажены на среду размножения. Клональное микроразмножение гибридных проростков семечковых культур осуществляли по традиционной модели пролиферации пазушных побегов. Введение в питательную среду 6-БАП вело к снятию апикального доминирования и стимулировало образование побегов из пазушных почек. Использование модифицированной питательной среды Кворина-Лепорье с соотношением регуляторов роста 1-2 мг/л 6-БАП, 0,5-1 мг/л ГК, 0,1-0,2 мг/л ИМК позволило получить к концу второго пассажа жизнеспособные конгломераты из 2-5 почек и побегов в большинстве комбинаций скрещивания.
На протяжении последующих трех пассажей происходило постепенное повышение коэффициента размножения гибридных проростков. Максимальный коэффициент размножения (9-14 новых побегов за пассаж через 6 месяцев после введения в культуру) отмечен у гибридов, полученных в комбинациях яблоня Богатырь х груша Августовская роса и груша Память Яковлева х яблоня А1.
Как известно, при культивировании in vitro гибридного материала, полученного при отдаленных таксономических скрещиваниях, могут наблюдаться различные аномалии роста, затрагивающие надземную и корневую части. В наших исследованиях в ряде случаев были отмечены морфологические изменения культивируемых побегов, такие как: утолщение стебля, изменение формы листовых пластинок, измельчение листьев, некроз верхушек побегов и некоторые другие.
С целью увеличения выхода растений при отдаленной гибридизации, кроме прямой регенерации растений из изолированных зародышей, использовали регенерацию адвентивных побегов из изолированных участков семядоли и каллуса. Поскольку не во всех вариантах скрещивания удалось получить гибридные проростки из целых зародышей, была проведена работа по индукции морфогенеза из изолированных участков семядолей непроросших зародышей. На средах с повышенным содержанием регуляторов роста растений все экспланты образовали каллус. Подбор оптимального соотношения цитокинина и ауксина позволил дополнительно получить побеги-регенеранты в комбинациях: яблоня А1 х груша Северянка, яблоня Антоновка х груша Бере зимняя Мичурина, яблоня Богатырь х груша Августовская роса. Образовавшиеся на семядолях побеги также включены в систему клонального микроразмножения гибридов.
После нескольких пассажей на среде размножения клоиально микроразмноженные гибриды были высажены на среду укоренения.
Отличительной особенностью полученных гибридов оказалась их достаточно низкая способность к укоренению в культуре in vitro. Укоренение зависит от физиологического состояния растения, которое во многом определяется внутренними биохимическими процессами, в результате которых образуется большое количество химических соединений, стимулирующих или ингибирующих ризогенез. Известно, что фитогормоны типа ауксинов являются стимуляторами ризогенеза, соответственно, процесс корнеобразования можно значительно активизировать, вводя в среды вещества с аналогичным действием.
Проанализировав литературные данные, мы убедились что основным индуктором корнеобразования в культуре in vitro плодовых растений является Р-индолилмасляная кислота (ИМК), которая добавляется в питательную среду обычно в пределах 0,5-1,0 мг/л.
Наши исследования показали, что эффективность укоренения микропобегов определяется как генотипом растения, так и концентрацией ауксина в питательной среде. Использование ауксина для укоренения полученных гибридов было обязательным. В контрольных вариантах на средах без регуляторов роста положительных результатов получено не было. Для определения оптимальной концентрации ауксина и получения максимального количества укорененных растений использовали несколько вариантов среды укоренения.
При добавлении в среду ИМК в концентрации 0,5 мг/л эффективность ризогенеза составила от 12,7 до 77,7 % в зависимости от генотипа. С увеличением концентрации ИМК в среде до 1 мг/л практически во всех комбинациях наблюдали и увеличение числа укорененных растений. Исключением является комбинация груша Память Яковлева х яблоня А1, в которой средний процент укорененных растений уменьшился с 77,7 %, при концентрации ИМК 0,5 мг/л, до 51,2 % при увеличении концентрации до 1,0 мг/л.
В результате исследований установлено, что процесс ризогенеза у отдаленных межродовых гибридов весьма длителен и составляет 3-4 месяца. Количество образовавшихся корней в большинстве комбинаций при этом весьма мало и составляет в среднем 1-4 на растение. При повышении концентрации ИМК в среде до 1,0 мг/л количество корней у эксплантов увеличивается незначительно, а иногда даже снижается, например, в комбинации яблоня Богатырь х груша Бере зимняя Мичурина.
Заключительным этапом клонального микроразмножения межродовых гибридов является адаптация полученных in vitro растений к естественным условиям.
Укорененные растения с искусственной питательной среды были пересажены в грунт, в малогабаритные пленочные теплицы с воздушно-капельным орошением. Под пленочным покрытием растения находились 1-1,5 месяца, затем пленку полностью снимали. В зависимости от генотипа адаптировано к естественным условиям от 14,5 до 37,5 % растений в каждой комбинации (табл. 2).

Таблица 2
Эффективность адаптации отдаленных гибридов в зависимости o r комбинации

Таким образом, в целом использование эмбриокультуры в селекции дает возможность получить жизнеспособные межродовые гибриды из семян с неполностью развитыми зародышами. Кроме того, эмбриокультура позволяет преодолеть отрицательное влияние различных негативных факторов на всхожесть семян, а также сократить период их покоя. Основная роль зародышевой культуры в селекции состоит в том, что с ее помощью удается вы- растить такие гибридные растения, которые в обычных условиях  получены быть не могут.

Литература

1. Банникова В.П. Цитоэмбриология межвидовой несовместимости у растений. - Киев, 1986.-230 с.
2. Руденко И.С. Отдаленная гибридизация и полиплоидия у плодовых растений. - Кишинев, 1978.-378 с.
3. Курсаков Г А. Отдаленная гибридизация плодовых растений / Всесоюзн. акад. с.-х. наук им. В.И. Ленина. - М.: Агропромиздат, 1986. - 112 с.
4. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура изолированных зародышей и генеративных органов как метод селекции плодовых растений // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений / Науч. труды ВАСХНИЛ. - М., 1979. -С. 57-69.
5. Здруйковская-Рихтер А.И. Экспериментальная эмбриология и получение новых форм растений // Бюл. Гос. никитского ботан. сада. 1987. - Вып. 62. - С. 112-116.
6. Разработка способов культивирования недоразвитых зародышей и завязей груши / С.П. Яковлев, А.В. Кожин, Е.Н. Луткова, Л.А. Дубовицкая // Тканевые и клеточные культуры в селекции растений / Науч. труды ВАСХНИЛ. - М., 1979.-С. 93-99.
7. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, № 13. - P. 473-497.
8. Quoirin M., Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. // /Acta Hortic. - 1977. - V. 78. - P. 437-442.