Возможности адвентивного органогенеза из соматических тканей малины

УДК 634.711.3:8.085
ВОЗМОЖНОСТИ АДВЕНТИВНОГО ОРГАНОГЕНЕЗА ИЗ СОМАТИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ МАЛИНЫ
С.Л. Расторгуев Мичуринский государственный аграрный университет, г. Мичуринск
Приведены данные о культивировании соматических тканей (листовых дисков и черешков) малины на искусственных питательных средах. Рассмотрена возможность индукции адвентивного органогенеза в системе in vitro. Изучено влияние на регенерацию адвентивных побегов внешних (гормональный состав среды, режим культивирования) и внутренних (генотип сорта, тип экспланта) факторов. Предложены варианты сред с сочетанием цитокинина и ауксинов, на которых получены адвентивные побеги с частотой до 48,2 %. Изменение основных условий культивирования привело к повышению уровня регенерации до 57 %.
Основными причинами, сдерживающими расширение площадей под малиной, являются: отсутствие сортов с высоким потенциалом адаптации к экстремальным факторам внешней среды, с сочетанием предельно выраженных хозяйственно-ценных признаков, трудоемкость ее возделывания и др. В связи с этим важная роль в повышении продуктивности плантаций малины в условиях все возрастающей нестабильности климата принадлежит селекционному улучшению уже существующих сортов. Однако традиционный селекционный процесс получения новых генотипов у плодовых культур довольно длительный.
В настоящее время для сокращения сроков создания биоразнообразия растений и ценных для селекции исходных форм используют современные технологии in vitro, которые базируются на методах культуры изолированных клеток, тканей и органов. Среди них особое внимание селекционеров привлекают приемы индукции сомаклональных вариантов, клеточной и тканевой селекции на устойчивость к стрессам, клонального микроразмножения ценных генотипов, получения трансгенных растений [1].
При культивировании соматических тканей в системе in vitro получены обнадеживающие результаты и выделены растения-регенеранты, характеризующиеся изменчивостью генеративных признаков и устойчивостью к неблагоприятным биотическим факторам среды [2].
Для широкого практического использования культуры изолированных тканей в селекционных исследованиях необходимы, прежде всего, хорошо разработанные системы регенерации растений. Это связано с тем, что способы индукции адвентивного органогенеза универсальны лишь только в общих закономерностях, а применительно к конкретным видам и даже сортам требуют корректировки. Установлено, что на способность изолированных тканей к регенерации оказывают влияние как внешние (химический и гормональный баланс питательной среды, условия культивирования), так и внутренние (генотип растения, тип и состояние экспланта) факторы [3, 4, 5]. Все это необходимо учитывать при поиске оптимальных условий более полной реализации морфогенетических потенций соматических тканей в системе in vitro.
Среди плодовых растений изолированные ткани малины характеризуются относительно высокой регенерационной способностью. Оптимизация приемов стабильного получения регенерантов позволит шире применять биотехнологические методы создания нового исходного материала для селекции малины.
Исследования посвящены изучению влияния генотипа исходных растений, типа экспланта, его положения на питательной среде, гормонального состава среды и режима культивирования (свет, температура) на уровень адвентивного органогенеза из листовых экс- плантов малины.
Объектами исследования для взятия эксплантов были сорта малины (Rubus idaeus L.) Карнавал и Комета, культивируемые in vitro на питательной среде Андерсона с добавками фитогормонов: 1 мг/л 6-БАП (этап размножения) и 0,5 мг/л ИМК (этап укоренения). В качестве исходных эксплантов в экспериментах по индукции адвентивного органогенеза использовали листовые диски и сегменты листовых черешков.
Для регенерации применяли агаризованную питательную среду по прописи Андерсона, в которую вводили цитокинин 6-БАП и ауксины 2,4-Д, ИУК, НУК. Были испытаны различные сочетания препаратов с цитокининовой и ауксиновой активностью.
Основные условия культивирования листовых эксплантов: t = 25 °С, 16-часовой фотопериод, освещенность 2000-3000 люкс. В экспериментах по стимуляции органогенеза изменяли световой и температурный режимы культивирования эксплантов: t = 25 °С, в темноте в течение трех недель; t = 4 °С, в темноте в течение трех недель.
Известно, что основными стимулами морфогенеза являются изменения соотношения фитогормонов в среде для культивирования, а также сам процесс выращивания растительных тканей вне организма. Стеблевой органогенез вызывали добавлением в индукционную среду более высокой концентрации цитокинина по отношению к ауксину. Были испытаны регенерационные среды с содержанием 6-БАП (1,2,5,10,15 мг/л) и одного из ауксинов 2,4-Д, ИУК, НУК в концентрации 0,1 и 0,5 мг/л.
В результате проведенных экспериментов отобраны варианты сред, на которых наблюдали регенерацию адвентивных побегов. При этом частота формирования побегов различалась по вариантам (от 3,3 до 48,2 %) и зависела от исходного генотипа и присутствующих в среде регуляторов роста. Отмечены варианты сред, которые обеспечивали наиболее высокий уровень стеблевого органогенеза (таблица).

Таблица
Регенерация адвентивных побегов из листовых эксплантов
малины (среда Андерсона, 30 г/л глюкозы, 7 г/л агара)

Экспериментальные данные показали, что наилучших результатов по регенерации адвентивных побегов удалось достичь в вариантах сред с содержанием 10 мг/л 6-БАП в сочетании с ИУК или 2,4-Д в концентрации 0,5 мг/л (20:1). Частота регенерации из листовых дисков и черешков составила 29,6-42,8 % и 34,9-48,2 % соответственно, т.е. этот показатель несколько выше у листовых черешков. Первые придаточные побеги в черешках появились примерно через 2-3 недели культивирования, а в листовых дисках через 4-5 недель. Листовые экспланты слабо реагировали на одновременное введение в состав регенерационных сред 6-БАП и НУК, что позволило получить лишь единичные побеги - регенеранты, причем это характерно для каждого из исходных сортов. Высокая (15 мг/л) или низкая (1 мг/л) концентрация 6-БАП в среде оказалась малоэффективной. Следует отметить, что изученные сорта отличались по способности к адвентивному органогенезу. Морфогенетический потенциал листовых тканей сорта Карнавал был выше.
На индукцию побегов определенное влияние оказала ориентация листовых дисков на поверхности питательной среды. Уровень регенерации несколько увеличивался, когда со средой контактировала абаксиальная сторона листа.

Установлено, что предварительное культивирование листовых эксплантов в полной темноте повышало частоту регенерации. Так, у сорта Карнавал при 16-часовом фотопериоде и t = 25° (контроль) адвентивные побеги образовывались примерно у 43 % листовых дисков, а увеличение часты регенерации до 57 % отмечено при их предварительном культивировании в темноте в течение трех недель при t = 25 °С (среда с 10 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК). Вместе с тем предварительное помещение эксплантов в темноту при t = 4 °С не оказало существенного влияния на повышение частоты регенерации. Аналогичный эффект при изменении основного режима культивирования отмечен у сорта Комета.
Индуцированные из соматических тканей адвентивные побеги могут быть мутантными и, следовательно, оказаться ценным исходным материалом для селекции малины. Для того, чтобы избежать возможной потери таких побегов, проводили их размножение и укоренение с помощью приемов клонального микроразмножения для создания идентичных копий. В качестве культуральной среды использовали среду по прописи Андерсона: на этапе микроразмножения добавляли 1 мг/л 6-БАП, на этапе ризогенеза - 0,5 мг/л ИМК. В результате были получены растения - регенеранты.
На основании проведенных экспериментов, можно прийти к заключению, что процесс индукции адвентивного органогенеза зависит от используемых генотипов (у сорта Карнавал этот показатель выше). Для изолированных листовых эксплантов характерны некоторые сортовые различия в морфогенетических реакциях на присутствие в питательной среде фитогормонов (соотношения цитокинин: ауксин). Из испытанных фитогормонов регенерационные процессы стимулировало одновременное присутствие 6-БАП и ИУК или 2,4-Д (20:1). Добавление НУК малоэффективно.
Для успешной регенерации адвентивных побегов необходимо, чтобы количество добавляемых в среду экзогенных регуляторов роста находилось в тесной связи с балансом эндогенных фитогормонов конкретного генотипа. Изменением основного режима культивирования можно добиться увеличения частоты регенерации побегов в системе in vitro. Оптимальное сочетание указанных факторов позволит обеспечить стабильный выход растений-регенерантов и тем самым повысить эффективность применения биотехнологических методов в селекционной практике.
Литература

1. Кашин В.И. Перспективы использования биотехнологических приемов в создании новых высокоадаптивных форм плодовых и ягодных растений / В.И. Кашин, В.А. Высоцкий // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Сб.докл. и сообш. XVIII Мичуринских чтений. - Мичуринск, 1998. - С. 8-14.
2. Тюленев В.М. Сомаклональная изменчивость земляники / В.М. Тюленев, Н.В. Соловых II Биотехнология. - 1999. - № 2. - С. 34-40.
3. Лебедев В.А. Потенциальные возможности адвентивного органогенеза у различных сортов груши / В.А. Лебедев, В.Н. Деменко, С.В. Долгов // Известия ТСХА. - 2004. - Вып. 4. - С. 81-87.
4. Муромцев Г.С. Основы сельскохозяйственной биотехнологии / Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокофьев. - М.: Агропромиздат, 1990.-384 с.
5. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro И Биотехнология сельскохозяйственных растений. - М.: Агропромиздат, 1997.-С. 105-133.