УДК 634.71:581.143.6:573.6
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ АДАПТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА RUBUS
Н.В. Соловых, В.М. Тюленев ГНУ
Всероссийский НИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина, г. Мичуринск
В процессе тканевой селекции ежевики и малино-ежевичных гибридов на устойчивость к засолению отобраны каллусы, сохраняющие способность к росту на средах, содержащих 0,6 % хлорида натрия. Из каллусов получены растения-регенеранты. Установлено, что у резистентных к засолению растений- регенерантов интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в листьях при стрессовых воздействиях различной природы увеличивается существенно меньше, чем в листьях контрольных растений. Таким образом, в процессе тканевой селекции получены генотипы с повышенной неспецифической толерантностью к дестабилизирующим воздействиям.
Интенсивное развитие сельскохозяйственного производства привело к созданию и широкому внедрению высокопродуктивных сортов, требующих при своем возделывании проведения многочисленных и часто дорогостоящих агротехнических мероприятий, в том числе обработок пестицидами. В то же время, медицинские требования к качеству сельскохозяйственной продукции предполагают существенное сокращение применения ядохимикатов, а желательно, и полное исключение их из технологического процесса. Для этого необходимы толерантные к различным болезням и вредителям сорта. Кроме того, для обеспечения устойчивого плодоношения ягодных культур в различных зонах при нестабильных погодных условиях и постоянном ухудшении экологической обстановки вследствие нарастания техногенных загрязнений нужны сорта с высоким потенциалом адаптации к комплексу неблагоприятных условий окружающей среды.
Выведение таких сортов для представителей рода Rubus особенно актуально.
Ежевика, в отличие от малины красной, не получила достаточно широкого распространения в России, в то время как в Европе и Северной Америке под ее насаждениями заняты большие площади. Следует отметить, что ежевика обладает хорошими вкусовыми качествами, пригодна для переработки, а комплекс содержащихся в ней витаминов и физиологически активных веществ делает ее незаменимым лекарственным сырьем. Кроме того, потенциальная урожайность ежевики существенно превышает урожайность малины красной [1]. Особый интерес для садоводства представляют малино-ежевичные гибриды, сочетающие полезные свойства родительских форм.
Распространение ежевики и малино-ежевичных гибридов, главным образом, в любительском садоводстве, и практически полное отсутствие промышленных насаждений данных культур обусловлено слабой зимостойкостью большинства сортов, их высокой требовательностью к увлажнению и большой поражаемостью болезнями и вредителями.
Поэтому особенно остро для данных культур стоит проблема получения высокоадаптивных сортов.
Применение биотехнологических подходов, в частности методов клеточной и тканевой селекции, позволяет существенно ускорить и удешевить процесс отбора перспективных генотипов за счет скрининга большого количества клеток в малом объеме и строго контролируемых условиях.
Во ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина проводятся работы по тканевой селекции ежевики сорта Блэк сэтин, у-мутанта-75 ежевики сизой, полученного О.С. Жуковым в результате хронического облучения на гамма-поле МО ВИРа, малино-ежевичных гибридов Логанберри и Бойсенберри на резистентность к засолению.
В основу метода положен отбор в селективных условиях каллусов, проявляющих устойчивость к соответствующему дестабилизирующему фактору, с последующей регенерацией из них растений.
В качестве селективного агента был использован хлорид натрия. Оптимальная для селекции концентрация NaCl была подобрана экспериментально и составила 0,6 %.
Путем поочередного культивирования на селективных и контрольных (без NaCl) средах удалось отобрать каллусы перечисленных выше форм рода Rubus, сохраняющие способность к пролиферации в селективных условиях.
Однако клеточная и тканевая устойчивость к различным стрессорам, которая является целью селекции in vitro, далеко не всегда соответствует устойчивости интактного растения, так как может являться лишь частью механизма резистентности. Поэтому необходимым этапом тканевой селекции является проверка на резистентность к соответствующим стрессорам растений-регенерантов.
Несмотря на то, что морфогенетический потенциал ежевики и малино-ежевичных гибридов сравнительно высок [2], индукция адвентивного морфогенеза из каллусов, прошедших длительное культивирование in vitro, связана со значительными трудностями.
Были разработаны методики индукции морфогенеза и получены адвентивные побеги из каллусов, прошедших культивирование in vitro в селективных условиях в течение 11 месяцев, у ежевики Блэк сэтин, у-мутанта-75 и гибрида Бойсенберри.
Оптимальными для регенерации являлись агаризованные среды с минеральным составом но прописям MS [3] и QL [4] витаминами по прописи MS, содержащие 30 г/л сахарозы или глюкозы. Положительное влияние на морфогенез оказывает замена в среде MS хлорида кальция на нитрат. Соотношение веществ цитокининовой природы и ауксинов 4:1 позволяет добиться воспроизводимых положительных результатов в области индукции морфогенеза.
В качестве вещества с цитокининовой активностью может быть успешно использован 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации 2-4 мг/л. Использование кинстина дает меньший процент регенерантов. Замена 6-БАП на тиадиазурон (ТДЗ) в концентрации 2 мг/л позволяет существенно (на 40-72 %) повысить выход адвентивных побегов у ежевики, применение вместо 6-БАП зеатина (1-3 мг/л) дает рост числа адвентивных побегов у гибрида Бойсенберри на 28,0-37,3 %.
В качестве ауксинов целесообразно использовать бета-индолил-бета- масляную кислоту (ИМК) и 3-индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрациях 0,2-0,5 мг/л. Применение 2,4-дихлорфеноксиуКсусной (2,4-D) и а-нафтилуксусной (НУК) кислот при попытках индуцировать морфогенез у ежевики и малино-ежевичных гибридов не дает положительного эффекта.
Повысить частоту адвентивного морфогенеза удается внесением в среды для регенерации антиоксидантов: аскорбиновой кислоты в концентрации 750 мкМ или глутатиона восстановленного в концентрации 100 мкМ.
Полученные адвентивные побеги прошли укоренение in vitro в присутствии 0,5-1,0 мг/л ИМК, адаптацию к условиям in vivo в пленочной теплице с воздушно-капельным орошением и были высажены в открытый грунт.
Среди растений-регенерантов было выделено 7 форм ежевики Блэк сэтин, 5 форм у-мутанта-75 и 3 форы гибрида Бойсенберри, обладающих повышенной устойчивостью к засолению. Полученные генотипы проходят изучение на засухоустойчивость, тесно коррелирующую с засолением.
Была установлена существенно более высокая радиорезистентность каллусов у-мутанта-75, отобранных на устойчивость к засолению.
Так, обработка у-излучением (Со60) в дозе 50 Гр снижала процент контрольных каллусов, сохраняющих пролиферационную способность, с 46,33 до 11,67, а процент отселектированных на устойчивость к засолению каллусов, сохраняющих способность к росту, с 51,33 до 24,00.
Радиорезистентность растений in vitro оценивали по коэффициентам размножения на среде MS в присутствии 1 мг/л 6-БАП после обработки у-излучением (1,0 ;5,0 ; 10,0 Гр). Растения, полученные из солеустойчивых каллусов, оказались существенно более радиорезистентными.
Механизм действия на растения различных стрессоров детально не выяснен. Но общим является повреждение биологических мембран вследствие перекисного окисления липидов (ПОЛ), развивающегося под действием активных форм кислорода. В литературе широко представлены данные о развитии окислительного стресса под влиянием ионизирующих излучений, засоления и закисления почв, экстремальных температур, поражения рядом фитопатогенов. Таким образом, устойчивость растений в значительной степени обусловлена активностью работы комплекса ферментов антиоксидантной системы [5].
Для оценки надежности антиоксидантной системы контрольных и отобранных на резистентность к засолению растений у-мутанта-75 изучали интенсивность перекисного окисления липидов в листьях в контрольных условиях и при стрессовых воздействиях. Оценку проводили по накоплению в листьях продукта окисления - малонового диальдегида (МДА), определяемого по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой [6].
Растения, полученные в процессе тканевой селекции на солеустойчивость, подвергали обработке у-излучением (5 Гр), вызывающим образование активных форм кислорода и окислительный стресс у растений, после чего определяли содержание МДА.
Установлено, что в листьях растений-регенерантов у-мутанга- 75, полученных из устойчивых к засолению каллусов, концентрация МДА повышается с 1,75±0,32 до 2,42±0,15, а в листьях контрольных растений с 1,88±0,13 до 3,10±0,45 мкМ/г сырого веса.
Это свидетельствует о повышении общего уровня неспецифической толерантности у отобранных методом тканевой селекции генотипов.
В проведенных во ВНИИГиСПР работах по тканевой селекции не удалось получить форм с максимальной специфической устойчивостью к различным стрессорам. Но отбор генотипов с повышенной надежностью работы антиоксидантной системы позволяет выделить растения с высокой толерантностью к комплексу неблагоприятных условий окружающей среды и, тем самым, повысить устойчивость садоводства.
Литература
- Казаков И.В. Малина и ежевика. - М.: Колос, 1994. - 142 с.
- Соловых Н.В. Совершенствование методик регенерации адвентивных побегов из соматических тканей представителей рода Rubus / Н.В. Соловых, В.М. Тюленев, С.А. Муратова // Ягодоводство на современном этапе: Материалы меж- дунар. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию со дня рождения А.Г. Волузнева. - Самохваловичи, 2004. - С. 217-219.
- Murashige Т. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture / T. Murashige, F. Skoog / Physiol. Plant. - 1962. -V. 15. - № 13. - P. 473-497.
- Quoirin M. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. / M. Quorin, P. Le- poivre / Acta Hortic. - 1977. - V. 78. - P. 437-442.
- Гудковский В.А. Окислительный стресс плодовых культур (факторы, механизмы, диагностика, повышение устойчивости) // Научные основы устойчивости садоводства в России: Материалы конф. 11-12 марта 1999. - Мичуринск, 1999.-С. 3-26.
- Стальная И.О., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диатьдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы биохимии. - М., 1977.-С. 66.
