Для опыта были избраны семь аминокислот, находящихся в винах в достаточно больших количествах, отличных по строению и физико- химическим свойствам. Из группы моноаминокарбоновых аминокислот исследовали валин и лейцин, из диаминомонокарбоновых — лизин, из моноаминодикарбоновых — глутаминовую кислоту, из оксиаминокислот — серин, из гетероциклических — триптофан, и серусодержащих — цистин.
Длительное хранение (630 суток) 0,05М. водно-спиртовых растворив аминокислот, содержащих 20%об. этилового спирта при pH 3,5, (называет понижение концентрации α-аминного азота, заметное даже при хранении в холодильнике (0—5° С).
В процессе выдержки при повышенной температуре (55—57° С в течение 275 суток и 20—25°С — 355 суток) потери аминного азота в растворе валина возросли в 7 раз, триптофана — в 5,6 раз, глутаминовой кислоты и серина — в 5 раз. Добавление глюкозы интенсифицировало процесс распада аминокислот как на холоду, так и при нагревании. Дополнительное понижение концентрации аминокислоты в присутствии танина наблюдается у серина и в меньшей степени в растворах валина и лейцина. У других аминокислот действие танина мало заметно. Сильно понижается концентрация глутаминовой кислоты в чистых растворах (не содержащих глюкозу или танин) вследствие се химической неустойчивости (рис. 1).
Степень окрашивания растворов обусловливалась природой аминокислоты и присутствием глюкозы или танина. В растворах чистых аминокислот (не содержащих глюкозу или танин) самая интенсивная окраска наблюдалась у цистина.
Более слабо окрашены были растворы лизина и триптофана. Растворы серина, валина, глутаминовой кислоты и лейцина оставались бесцветными. В присутствии глюкозы неокрашенным оставался только раствор глутаминовой кислоты. С танином все исследуемые нами аминокислоты образовывали интенсивную коричневую окраску. Раствор чистого танина оставался бесцветным, но в нем выпадал бурый осадок. Параллельно с окраской растворы приобретают способность флуоресцировать в ультрафиолетовом свете. Неокрашенные или слабо окрашенные растворы обладают, как правило, голубой или молочно-белой флуоресценцией, которая по мере побурения растворов становится желтой и интенсивно желтой.
Все варианты растворов, подвергавшиеся нагреву, отличались интенсивным своеобразным запахом (табл. 1). Растворы, выдержанные в холодильнике, имели более слабый аромат, отличающийся от аромата образцов, выдержанных при более высокой температуре, не только интенсивностью, но и своей природой. Как правило, они были менее интересными и разнообразными.
Таблица 1. Характеристика аромата водно-спиртовых растворов аминокислот (выдержка 275 суток при температуре 55—57 °C)
В результате распада отдельных аминокислот в растворе обнаружены вещества с карбонильными группами и аммиак. Их выходы (табл. 2) оказались ниже рассчитанных по понижению концентрации аминного азота согласно схеме реакции окислительного дезаминирования, предполагающей молярное соотношение между исходной аминокислотой и концентрацией образовавшегося альдегида и аммиака, равным 1 : 1.
Таблица 2.
Содержание карбонильных групп и азота аммиака (в моль/л 10-4) в растворах аминокислот (выдержка 275 суток при температуре 55—57о С и 355 суток при 15—20 С)
Хроматографирование 2,4-динитрофенил гидразонов, осажденных из реакционной смеси, показало, что карбонильные соединения, образующиеся в растворе аминокислоты, неоднородны, а состоят из нескольких компонентов (рис. 2).
В растворах различных аминокислот обнаружены гидразоны с одинаковым Rf, принадлежащие, по-видимому, к одинаковым по строению альдегидам. В самых больших количествах образуется уксусный (или муравьиный) альдегид, пятно которого обнаружено на всех хроматограммах.
Опыты по исследованию продуктов дезаминирования отдельных аминокислот позволили установить следующее. Окислительный распад аминокислот в водно-спиртовых растворах в условиях длительной выдержки может идти при низких температурах (в пределах 0—5о С). С повышением температуры до 55—57° С скорость реакции разложения увеличивается в 2—6 раз. Повышение температуры вызывает по только количественные, но и качественные изменения в ходе дезаминирования, что можно заметить ио изменению интенсивности и природы аромата исследуемых нами растворов аминокислот. Сложность и разнообразие запахов, возникающих в растворах, выдерживаемых при повышенных температурах, свидетельствуют о появлении новых химических соединений, вероятно полимеров — продуктов распада углеродного радикала аминокислот. Усиление процесса деградации аминокислоты в присутствии глюкозы вызвано возникновением сахароаминных реакций, ведущих к образованию темно окрашенных веществ типа меланоидинов. Глубина этого процесса зависит от природы аминокислоты, что можно заметить по интенсивности окраски растворов разных аминокислот. Понижение концентрации аминокислоты, вызванное присутствием глюкозы, не всегда коррелирует с интенсивностью появившейся окраски (пример — валин). По-видимому, в этих случаях реакция останавливается преимущественно на I стадии меланоидинообразования — появлении N-замещенных глюкозиламинов, не вызывающих окраски. При взаимодействии с глутаминовой кислотой сахароаминная реакция не идет дальше образования Ν-замсщенных глюкозиламинов (раствор остается бесцветным).
Интенсификация процесса распада аминокислоты наблюдается и в присутствии танина. Известно, что танины активно реагируют с альдегидами и другими карбонильными соединениями, образующимися в результате деградации аминокислот [2].
Усиление процесса распада может быть вызвано постоянным нарушением состояния равновесия между аминокислотами и продуктами их распада вследствие связывания их танином. Не исключена также возможность влияния танинов как сильных редуктонов ароматического типа, вызывающих разложение аминокислоты по схеме Штрекера. В пользу этой гипотезы говорит и более высокая концентрация аммиака в опытах с танином. Немаловажное значение в реакциях, происходящих в присутствии танина, имеет и природа аминокислоты. Так. процесс понижения концентрации аминокислот под влиянием танина в растворах серина и лейцина идет более интенсивно, чем вследствие сахаро-аминных реакций.
В растворах глутаминовой кислоты, не содержащих глюкозу или танин, концентрация понижается более сильно. Это можно объяснить легким разложением глутаминовой кислоты при нагревании, что в значительной мере маскирует процесс окислительного распада под влиянием танина и вследствие взаимодействия с глюкозой. Неустойчивость глутаминовой кислоты к нагреванию отмечалась нами [16] и другими авторами [25].
При распаде аминокислот образуются вещества с карбонильными группами. Их концентрация не достигает теоретического выхода, подсчитанного по убыли концентрации аминного азота согласно схеме реакции, указанной выше. Очевидно, это объясняется их высокой реакционной способностью. В условиях концентрации, применяемых в наших опытах, могут происходить процессы полимеризации или взаимодействия с другими продуктами реакции, присутствующими в растворе (аммиак, глюкоза, танины).
Важно отметить, что из растворов различных аминокислот выделены гидразоны одинаковых по строению альдегидов, в частности уксусный альдегид. Следовательно, при распаде аминокислоты преобладает процесс отщепления одинаковых радикалов СН3 — СН, гидроксилирование и последующее окисление которых ведет к образованию уксусного альдегида. Такое отщепление можно легко представить, исходя из строения молекулы аминокислот, которые можно рассматривать как производные α-аланина.
Кроме альдегидоз, общих для всех аминокислот, образуются также альдегиды, содержащие на один углеродный атом меньше, чем исходная аминокислота, как это предусматривает схема распада по Штрекеру. К ним относятся изовалерьяновый альдегид, обнаруженный в растворе лейцина, и изомасляный, найденный в растворе валина. Основой образующегося при выдержке аромата являются, вероятно, кроме альдегидов, образующихся по схеме Штрекера, гидроксильные и карбонильные производные органического радикала аминокислоты, дающие с 2,4-динитрофенилгидразином вещества типа озазонов. При хроматографировании гидразонов они образуют стартовое пятно. Общие для разных аминокислот карбонильные соединения участвуют в образовании букета как вещества, создающие фон аромата.
Колебания концентрации аммиака в растворе должны характеризовать, в известной мере, интенсивность реакций, проходящих по схеме Штрекера. Как видно из полученных результатов, концентрация аммиака в растворе намного ниже теоретического выхода. Поскольку образование аммиака вследствие дезаминирования является неизбежным, понижение его концентрации в растворе объясняется, по-видимому, вступлением его во вторичные реакции взаимодействия с продуктами распада аминокислот или веществами, присутствующими в растворе. Реакция с карбонильными соединениями, например, ведет к образованию альдегидаммиаков — продуктов полимеризации альдегидиминов. Последние могут образоваться из оксиаминов вследствие отщепления молекулы воды. Альдегидаммиаки образуют полимеры, не подвергающиеся щелочному гидролизу, вследствие чего азот аммиака в них не определяется. Возможно также прямое присоединение аминогруппы к карбонильному соединению с образованием аминов. На возможность подобной реакции указывают Гербст и Энгель [35]. Подвергая в присутствии пировиноградной кислоты окислительной деградации фенилаланин, эти авторы обнаружили в реакционной смеси аланин.
Более активное накопление аммиака в присутствии танинов зависит, как указывалось, от интенсификации процесса распада согласно реакции Штрекера.
