Изменение активности ферментов и состава виноградного сусла и вина при обработке иммобилизованными протеиназами
Свойства фермента виноградной ягоды и изменения их активности при обработке сусла бентонитом, теплом, сернистым ангидридом исследовались в нескольких работах. Так, работы Г. Кордонье и др. (1968) были посвящены протеиназе, В. И. Нилова (1960), Р. К. Миндадзе, Е. Н. Датунашвили, Н. К. Бокучава (1975) — ферменту орто-дифенолоксидазе, Н. А. Мехузла, Г. В. Кургановой и А. А. Максимовой (1975) — пектиназам.
Практический интерес представляют исследования изменений белковых веществ и активности β-фруктофуранозидазы и протеиназы шампанских виноматериалов при обработке виноматериалов и их шампанизации (Орешкина, Новикова, 1975; Кишковский, Сахарова, Коссобудская, 1975). Сведений об изменениях активности ферментов виноградного сусла в процессе гидролиза белковых веществ иммобилизованными протеиназами в литературе нами не найдено.
С целью изучения гидролитического действия грибных протеиназ на наиболее важные с технологической точки зрения ферменты винограда, такие как пектинэстераза (ПЭ), полигалактуроназа (ПГ), протеиназа (ПС), орто-дифенолоксидаза (о-ДФО) и Сх фермент (Гаина, Тюрина, Мендадзе, 1976) были получены белковые препараты из свежеотжатых сусел различных сортов винограда. Выделение белковых препаратов осуществлялось на холоде по методике, описанной нами ранее. Полученные из них растворы виноградного протеина обрабатывались в колоночных реакторах с иммобилизованным протаваморином (протаваморин Г25х) при температуре 25°С.
Результаты гидролиза белкового препарата из сусла винограда сорта Мускат белый представлены в таблице 50. При общем снижении белков па 64% наблюдаются значительные различия в действии грибной протеиназы на исследуемые ферменты винограда. Так, активность ПЭ в результате протеолиза уменьшилась в 13 раз, о-ДФО — в 4,6 раза, ПС — в 3, Сх фермента — в 2,7 раза, а активность ПГ снизилась всего в 1,3 раза.
Таблица 50
Изменение активности ферментов в виноградном сусле под действием иммобилизованного протаваморина Г25х
Различная атакуемость ферментных белков обусловливается, очевидно, особенностями их структуры, а также субстратной специфичностью иммобилизованной грибной протеиназы (Фролова, 1974).
Снижение активности ПЭ белкового препарата может иметь важное технологическое значение в производстве продуктов детского и диетического питания в результате уменьшения содержания метанола в них. Понижение активности окислительных ферментов благоприятно скажется на формировании букета и вкуса готового сока и вина. И, наконец, сопряженность действия ПГ виноградного сока и иммобилизованной кислой протеиназы позволит повысить эффект воздействия на коллоидную систему сока, выраженный в снижении содержания белков, пектиновых веществ, вязкости и мутности.
Среди окислительных ферментов виноградного сока о-ДФО занимает особое место в технологии производства высококачественных соков и малоокисленных вин. Подавление активности этого фермента в сусле введением сернистой кислоты не всегда представляется возможным (например, в производстве коньячных и сокоматериалов), а обработка бентонитами снижает ее лишь частично, С целью изучения протеолиза белка, обладающего о-ДФО активностью, препараты белка сортов Каберне-Совиньон, Ркацители и других обрабатывались на колонках с иммобилизованными протеиназами.
Таблица 51
Гидролиз белка, обладающего о-ДФО активностью, иммобилизованным протаваморином
В результате удалось установить, что белок, обладающий о-ДФО активностью атакуется кислыми протеиназами лучше по сравнению с другими белками, присутствующими в суммарном препарате (табл. 51). Содержание белка в препарате, выделенном из сусла сорта Каберне-Совиньон, снизилось на 52%, активность о-ДФО — на 54%; в препарате белка из сорта Ркацители количество белка снизилось на 60%, а активность о-ДФО — на 70%. Лучше атакуемость белка, обладающего о-ДФО активностью, наблюдается в случае выделения его из сусла сорта Мускат белый.
Сравнительно невысокую степень гидролиза суммарного белка в препаратах, выделенных из сусла различных сортов винограда, а также белков виноградного сока, обладающих ферментативной активностью (ПГ, с-ДФО, Сх ), очевидно, можно объяснить образованием комплекса белка с другими полимерами (полисахаридами, фенольными веществами), что и затрудняет их гидролиз. Согласно литературным данным (Деревицкая, 1969), полисахариды, образуя комплексы с белками, создают своеобразную зону защиты вокруг белка, затрудняя тем самым доступ протеиназ к субстрату.
В сезон переработки винограда 1973 и 1974 гг. на Севастопольском соковом и Бахчисарайском консервном заводах из производственных партий сусла были получены образцы сокоматериалов обработкой сусла иммобилизованными кислыми протеиназами. Опытные образцы виноградного сусла обрабатывались на колонках с иммобилизованными ферментами, а контрольные — на колонках с чистым носителем. Предварительно сусло отделяли от основной массы грубых взвесей фильтрацией или центрифугированием на центрифуге «Вестфалия».
Обработка свежеотжатого виноградного сусла иммобилизованным протаваморином привела к снижению содержания белковых веществ в опытных образцах сокоматериала сорта Алиготе на 77%, метанола — на 49%, для сорта Ркацители — соответственно на 77 и 51%. Белки сусла из сорта Бастардо магарачский были прогидролизованы на 59%, тогда как снижение количества метанола в обрабатываемых вариантах составляло 60% (табл. 52).
Таблица 52
Влияние обработки виноградного сусла иммобилизованной кислой протеиназой на технологические показатели сокоматериала
Метиловый спирт образуется в результате деметоксилирующего действия пектинэстеразы на пектиновые вещества сусла. Меньшее содержание метанола в сокоматериалах, обработанных иммобилизованным протаваморином, по сравнению с контрольными соками свидетельствует о гидролизе белка, обладающего пектинэстеразной активностью. Это было подтверждено опытом по определению активности ПЭ в сусле до и после протеолиза; конечная — существенно ниже исходной.
Опытные образцы сокоматериалов характеризовались более низким значением ОВ-потенциала: 352—366 мВ против 403—412 мВ в контрольных.
Дегустационная оценка сокоматериалов показала, что опытные образцы были более высокого качества по сравнению с контрольными и характеризовались сортовым букетом и гармоничным вкусом.
Таким образом, протеолиз виноградного белка сусла иммобилизованными кислыми протеиназами при обработке виноградного сокоматериала с целью стабилизации готовой продукции против белковых помутнений ведет к существенному снижению активности ПЭ, о-ДФО, Сх ферментов. Сопряженность действия ферментов виноградной ягоды и иммобилизованных кислых протеиназ повышает эффективность использования ферментативного катализа в производстве сокоматериалов и вин.
Аминокислоты как часть азотистого комплекса играют важную роль в технологии получения высококачественных вин различного типа (Америн, 1954; Валуйко, 1959; Зинченко, 1966). Учитывая их биологическую ценность, технологи стараются сохранить или повысить их содержание в соках (Пуп, 1970), или уменьшить их в винах, так как аминокислоты могут вступать в реакцию окислительного дезаминирования и вызывать переокисленность столовых вин, шампанского (Нилов, Датунашвили, 1961; Унгурян, Орешкина, 1963; Зинченко, 1966).
Таблица 53
Изменение содержания свободных аминокислот в сусле и вине сорта Алиготе под действием иммобилизованного протаваморина Г25х (мг/л)
И наоборот, большие количества аминокислот и азотистых веществ в крепленых виноматериалах позволяют при использовании мягких технологических режимов обработки теплом получить портвейн, мадеру, херес высокого качества (Кишковский, 1966; Балануцэ, 1972).
Изменения аминокислого состава сусла и вин при их обработке иммобилизованными кислыми протеиназами определялись с использованием аминоанализатора «Аминохром» (Венгрия).
Полученные нами результаты по обработке сусла, столового и крепленого виноматериала, приготовленных из сорта винограда Алиготе (табл. 53), показывают, что протеолиз белковых веществ на 87—90% их исходного состояния (сусло—166 мг/л, столовое вино— 67 мг/л и вино типа портвейн —48 мг/л) привел к увеличению содержания суммы аминокислот соответственно на 33, 16 и 12 мг/л.
Исследование количественного содержания свободных аминокислот в виноградном сусле из различных сортов предгорной части Крыма, полученных обработкой растворимым и иммобилизованным на титановом порошке ПТЭМ-1, протаваморином Г25х, показали (табл. 54), что сусла, полученные обработкой растворимой протеиназой, богаче аминокислотами, чем образцы, приготовленные иммобилизованными ферментами. Тем не менее во всех обработанных протеиназой суслах и винах содержание свободных аминокислот было выше на 16—33 мг/л (исключение составляют лишь крепкие вина, где прирост незначителен).
Сусло из винограда сортов Мускат белый, Каберне и Рислинг характеризуется более богатым содержанием аминокислот, в том числе и незаменимых (от 2020 до 3668 мг/л), меньше аминокислот в соке сортов Ркацители и Алиготе (1056—1440 мг/л). Это—проявление сортовых особенностей в конкретных экологических условиях произрастания винограда.
Исследование глубины гидролиза виноградного протеина (по общему количеству прогидролизованного белка, расщепленного до аминокислот) показало, что прирост свободных аминокислот в обрабатываемых протеиназами соковиноматериалах зависит от исходного содержания белка (в условиях наших опытов степень гидролиза составляла 35—95%) и от вида применяемого фермента (табл. 55). Так, при обработке сокоматериалов и вин растворимым протаваморином прирост суммы свободных аминокислот па 50—60% больше, чем в вариантах с применением иммобилизованного. На основании анализа полученных результатов можно сделать вывод о том, что протеолиз виноградного протеина иммобилизованными кислыми протеиназами идет преимущественно до полипептидов. Очевидно, это можно объяснить большим снижением пептидазной активности растворимых кислых протеиназ при их иммобилизации по сравнению со снижением общей протеолитической активности.
Таблица 54
Содержание аминокислот в сусле различных сортов винограда при их обработке протаваморином
Таблица 55
Глубина гидролиза протеина в сокоматериалах и винах растворимым и иммобилизованным протаваморином
Интерес ученых-энологов к пептидам с теоретической п практической точек зрения в последние годы возрос (Наниташвили, 1972; Авакянц, 1980). Высказывались мнения, что пептиды влияют на полноту вина, игру и пенистые свойства шампанского (Мержаниан, 1961; Нилов, Скурихин, 1967) и принимают активное участие в биохимических превращениях на стадии формирования и созревания вина (Родопуло, 1966). И в этом отношении применение иммобилизованных кислых протеиназ взамен растворимых при стабилизации молодых вин и виноматериалов, идущих на длительную выдержку, имеет существенное преимущество.
Осуществление протеолиза виноградного белка преимущественно до полипептидов с минимальным накоплением свободных аминокислот положительно скажется на качестве столовых, шампанских и полусладких вин, снижая их потенциальную склонность к переокисленности.
Неоднократно проведенные производственные дегустации вин, полученных при обработке в реакторах с иммобилизованными протеиназами, показали большую полноту во вкусе опытных вин по сравнению с контрольными винами, приготовленными по существующим технологическим схемам.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что наибольшим изменениям при обработке сусла и вина иммобилизованными кислыми протеиназами подвергаются белковые вещества и другие коллоиды. В основном же химический состав соков и вин практически не изменяется. При этом сохраняются высокие органолептические качества исходных соков и виноматериалов. Гидролиз виноградного протеина обеспечивает повышение биологической ценности и диетических свойств готового продукта; увеличивается содержание аминокислот (в том числе и незаменимых) и легко усвояемых организмом пептидов.
