Использование математических моделей при анализе качества коньячной продукции

Б. Ц. Зайчик, А. О. Ружицкий, В. П. Хотченков, И.В. николаев, О. в. Королева
Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН
С. С. Щербаков
РГАУ—МСХА им. К. А. Тимирязева
Ключевые слова: коньяк, качество, кластерный анализ, метод главных компонент
Key words: brandy, quality, cluster analysis, principal components method

Развитие технологий производства алкогольных напитков, значительное расширение ассортимента и включение в технологическую схему производства вспомогательных материалов (красители, ароматизаторы, консерванты, растительные экстракты) делает насущной проблему контроля качества и аутентичности винодельческой продукции, в том числе коньяков.

Понятие качество для коньячной продукции, как и для любого пищевого продукта, определяется соответствием характеристик продукта определенным критериям, среди которых можно выделить технологию производства продукта, органолептические и физико-химические характеристики конечной продукции.
Качественным коньяком можно считать продукт, соответствующий нормативной документации, с характерным набором маркеров и удовлетворительной органолептической оценкой [1].
В международной практике при анализе крепких алкогольных напитков изучают достаточно широкий спектр физико-химических характеристик: в частности, критериями качества продукции выступает содержание различных добавок, антиоксидантов, маркеров подлинности (соотношение изотопов различных элементов, количество биофлавоноидов и др.) [2-5]. К тому же современные международные тенденции показывают, что помимо контроля качества необходим и контроль безопасности продукции. Применение современных методов анализа в Российской Федерации несколько ограничено в силу недостаточного распространения современных инструментальных методов. Но даже при наличии оборудования требуются отработанные протоколы анализа продукции, а также установление взаимосвязей между ними и традиционно используемым при оценке органолептическим тестированием.
Набор показателей, необходимый для установления качества коньяка, в настоящее время определяет соответствующая нормативная документация, но ее, к сожалению, недостаточно для точного установления аутентичности продукции.
Выбор дополнительных маркеров обусловлен ключевыми стадиями производства коньячной продукции: приготовление коньячных виноматериалов, получение коньячных спиртов, их выдержка и приготовление коньяков [6].
Получают коньячные спирты путем дистилляции, и, значит, основную роль играют летучие вещества, впоследствии формирующие аромат готового продукта. Обычно для анализа летучих веществ используют газохроматографические методы.
Отличительная особенность коньячного производства — выдержка коньяка в дубовых бочках, где происходят экстракция фенольных соединений и трансформация лигнина. Для изучения продуктов, переходящих в коньяк на этой стадии, можно использовать различные методы, в том числе метод определения антиоксидантной емкости (АОЕ). Ее можно считать маркером качества, поскольку продукция, полученная без нарушений технологических инструкций, должна обладать достаточно высокой АОЕ в связи с наличием в ее составе широкого спектра фенольных компонентов, являющихся продуктами многоступенчатого процесса трансформации лигнина и танинов дуба и переходящих в коньяк в процессе выдержки с образованием физиологически активных соединений. Пример таких соединений — ароматические альдегиды (синаповый, конифериловый, сиреневый и ванилин), которые, по данным исследователей, могут служить маркерами возраста и качества коньячной продукции [7-10].
Для оценки содержания ароматических альдегидов можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию либо капиллярный электрофорез [11-14]. Исследования коньячной продукции, проведенные в последние годы, дают представление о составе коньяка, но не дают возможности оценить качество образца.
Таким образом, цель настоящей работы — выбор критериев для оценки качества коньячной продукции и определение корреляций между физико-химическими параметрами и органолептическим тестированием.

Условия эксперимента.

Объектами для исследования служили 112 образцов коньячной продукции отечественных и зарубежных производителей, отобранные из розничной сети. Данные о производителе и возрасте коньяка взяты с этикеток соответствующих образцов, то есть они заявлены производителями и проверке не подвергались.
Водородный показатель (рН) коньяка определяли на рН-метре Checkery Hanna (Германия) с комбинированным стеклянным микроэлектродом, предварительно откалиброванным по стандартным буферным растворам. Антиоксидантную емкость коньяка по отношению к пероксильному радикалу (Oxygen Radical Absorbance Capacity ORAC-FL) находили по методике, разработанной B. Ou и сотр. [15], а по отношению к катион-радикалу ABTS (TEAC) — по методу, описанному в работе R. Re и сотр. Мы также провели оптимизацию самого метода [16-18].
Общее содержание фенольных соединений определяли с помощью реактива Фолина — Чокальтеу по методу V. L. Singleton с сотр. В качестве стандартов использовали галловую кислоту и тролокс. Результаты, нормированные на тролокс, позволяют сравнить их с показателями антиоксидантной емкости.
Ароматические альдегиды определяли методом капиллярного электрофореза на системе высокоэффективного капиллярного электрофреза (ВЭКЭ) «Beckman Coulter P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System». Полученные электрофореграммы автоматически обрабатывали и анализировали с помощью системы «32 Karat 8.0». Условия проведения электрофореза аналогичны условиям, указанным в работе Паносяна и сотр.
Состав летучих компонентов выявляли методом газовой хроматографии с использованием пробоподготовки в предложенной нами модификации, заключающейся в барботировании образца инертным газом с последующим криоконцентрированием летучих компонентов в ловушке, что позволяет отселектировать летучие компоненты, непосредственно участвующие в создании запаха коньяка [19, 20]. Хроматографическое разделение проводили на хроматографе Shimadzu GC 2010 с масс-детектором GCMS-QP-2010 [21].
Цветовые характеристики (интенсивность, оттенок, относительную яркость) определяли согласно рекомендациям МОВВ [22].
Органолептическую оценку проводили по 100-балльной системе, описанной Г. Г. Валуйко [23].
Для статистической обработки использовали программу Биостатистика и Microsoft Excel XP. Достоверными принимались различия при р < 0,05.
Анализировали полученные данные с помощью 2-этапного кластерного анализа и метода главных Результаты и обсуждение. Суть 2-этапного кластерного анализа состоит в разделении имеющегося массива экспериментальных данных на некоторое число типов различных кластеров с дальнейшим выделением наиболее информативных признаков кластеризации.

Цель проведения кластерного анализа — разделение образцов на группы с максимальными различиями между ними. При анализе предварительно приняли решение об использовании фиксированного числа кластеров (2): для разделения образцов на некачественные (кластер, или группа 1) и качественные (кластер, или группа 2). Достоверными различиями между группами считаются различия с р < 0,05. Доверительные интервалы по группам рассчитаны при α = 0,05.
На практике оценить для каждого образца такое количество параметров достаточно сложно, поэтому с помощью этого же анализа мы попытались выделить факторы, оказывающие наиболее существенное влияние на оценку качества коньяка и способные с наибольшей достоверностью служить маркером его аутентичности. Также необходимо учитывать, что измерения ряда параметров достаточно трудоемки и затратны (например, антиоксидантная емкость по протоколу ORAC-FL), а другую часть параметров можно считать методами экспресс-контроля. В связи с этим очень важен выбор оптимальных параметров контроля, учитывающих все факторы (временной, экономический и т. п.).
После просмотра различных комбинаций критериев, вводимых в качестве исходных параметров двухэтапного кластерного анализа, исходными данными были выбраны этиловый эфир октановой кислоты, антиоксидантная емкость по отношению к катион-радикалу ABTS, общее содержание фенольных соединений и интенсивность цвета (табл. 1).
Образцы разделены на группы согласно выбранным критериям (табл. 2) и определены средние значения выбранных параметров по кластерам (табл. 3).
В результате кластерного анализа все образцы были разделены на две группы, так что различие по этим группам по выбранным признакам достоверно.
Для верификации кластерного анализа провели дегустационную оценку образцов и разделили их на 2 группы. Коньяки, получившие более 85 баллов, условно признали аутентичными (n = 70, кластер 2), а набравшие 84 балла и менее названы фальсифицированными (n = 31, кластер 1).
Для каждого из разделений рассчитали средние значения дополнительных параметров и достоверность различий между ними по сформированным группам. В результате расчетов группы достоверно различаются по содержанию этилового эфира гексановой кислоты, показателям рН, АОЕ по методу ORAC, относительной яркости цвета, количеству сиреневого альдегида. А недостоверные различия наблюдаются по содержанию этилового эфира декановой кислоты, оттенку цвета и концентрации ванилина. Недостоверные отличия по оттенку можно объяснить тем, что цвет коньяка создается сахарным колером, а ванилин добавляется в некачественные коньяки для придания аромата.
Таким образом, можно сделать вывод, что по показателям оттенка и содержанию ванилина (кроме случаев, когда его количество настолько велико, что однозначно можно говорить об искусственном введении ванилина в напиток) нельзя судить о качестве продукции.
Сравнение средних значений по критериальным признакам в зависимости от разделения показало, что они очень близки между собой, и это дает возможность определить количественные границы качества по показателям.
Полученные значения выбранных критериальных признаков согласуются с данными литературы (в частности, по данным И. М. Скурихина, в аутентичных образцах содержится 300-550 мг/дм³ фенольных соединений). Значения антиоксидантной емкости сопоставимы с данными N. Pellegrini с сотр. (1290 мкмоль/дм³). При использовании коммерциализованного набора TAS RANDOX с ферментативной генерацией катион-радикала ABTS непосредственно в реакционной среде D. M. Goldberg и др. также получили сравнимые величины АОЕ коньяка (2500±300 мкмоль/дм³) [24].

Таблица 1

Для визуализации и сравнения данных разделения по кластерам и исходя из органолептической оценки анализировали полученные данные с использованием метода главных компонент.
Для анализа во всех случаях использовали два принципиальных компонента: с одной стороны, такого количества достаточно для описания большинства вариаций, а с другой, при увеличении числа принципиальных компонентов каждый следующий компонент затрудняет интерпретацию данных и вносит меньший вклад, чем предыдущий.
В качестве исходных данных в программу вводили таблицу (в строке — номера образцов, а в столбцах — полученные экспериментальные данные).
Возможность применения метода главных компонент для анализа коньячной продукции показана в работе Gomez-Cordovez C. и сотр. [26]. В качестве объективных характеристик использовали цветовые характеристики (интенсивность, оттенок), общее содержание фенольных веществ, количество катехинов и рН. Но этих параметров, по мнению Gomez-Cordovez C. и сотр., недостаточно для полной оценки качества продукта.
В качестве исходных данных дегустационную оценку не вводили. Полученный результат разделения образцов по результатам дегустационной оценки сравнивали с разделением образцов по соответствующим экспериментальным данным и результатами кластерного анализа.
Результаты анализа методом главных компонент по факторам антиоксидантной емкости с использованием катион-радикала АБТС, интенсивности цвета, общего содержания фенольных соединений и количества этилового эфира октановой кислоты покрывают 80,3 % вариаций и дают достаточное разделение между облаками. С другой стороны, измерение этих параметров не столь трудоемко, как, например, измерения антиоксидантной емкости по протоколу ORAC-FL, хотя при этом незначительно улучшается качество разделения облаков.

На построенной с помощью программы SPSS 17.0 диаграмме по результатам кластерного и органолептического разделения выделены аутентичные образцы, фальсифицированные и образцы, где результаты кластерного анализа не совпадают с органолептической оценкой. Все образцы достаточно четко разделились на 3 группы, причем образцы, у которых расходятся результаты кластерного анализа и органолептической оценки, занимают промежуточное положение между фальсифицированными и аутентичными образцами.
Таким образом, результат анализа методом главных компонент подтверждает значимую корреляцию данных инструментального анализа, дегустационной оценки и кластерного анализа как метода выбора критериев оценки аутентичности.
Результаты отнесения образцов к группам согласно кластерному и органолептическому разделениям отличались у 15 образцов, которые, в свою очередь, также можно разделить на 2 группы: 3 образца (21f, 25f, 27f) по результатам органолептического тестирования признаны фальсифицированными, а по результатам кластерного анализа — качественными, остальные 12 (3au, 28au, 29au, 36au, 45au, 51au, 54au, 59au, 60au, 62au, 64au, 65au) образцов находятся в обратной ситуации. Для установления их качества рассмотрены дополнительные параметры, не включенные в качестве критериев в кластерный анализ. Следует отметить, что дегустационная оценка этих 15 образцов тоже близка к границе между фальсифицированными и аутентичными образцами.
В результате у двух образцов (25f, 27f) из 1-й подгруппы фальсификацию можно подтвердить по значению рН и отсутствию сиреневого альдегида, два других образца по всем показателям находятся на границе между фальсификатами и аутентичными образцами (21f).
Для образцов, признанных аутентичными по результатам органолептического тестирования, но по результатам кластерного анализа отнесенных к группе некачественных после детального рассмотрения физико-химических характеристик, можно сделать следующие выводы: 59au, 62au из 12 образцов находятся на границе между фальсификатами и аутентичными, остальные справедливо отнесены к фальсифицированным по содержанию фенольных соединений (3au, 28au, 29au, 36au, 45au, 51au, 54au, 60au, 64au, 65au).

Таблица 3

Пограничные образцы можно с уверенностью отнести к фальсифицированным по возрасту, так как многие образцы на границе можно отнести к качественным, если по своему наименованию они являются ординарными; в случае, если на этикетке нет указаний об их выдержанности (марочные), они относятся к фальсифицированным.
Из пограничных образцов 21f, 59au, 62au на этикетке образца 21f указано, что время выдержки в дубовой бочке составляет 3 года, у остальных — 10 лет и более; следовательно, образец 21f можно считать качественным, а другие два — нет.
Используя дополнительные характеристики образцов, удалось установить принадлежность к группам всех образцов; для 13 из 15 образцов при отнесении к группам кластерный анализ оказался более корректным, чем органолептический анализ.
Таким образом, кластерный анализ дает более точные результаты по сравнению с органолептическим тестированием, так как его проводили инструментальными методами только на основе физико-химических характеристик. Из 112 исследованных образцов ошибки при разделении с использованием кластерного анализа обнаружены всего в двух образцах.

Выводы.

Проведенный двухэтапный кластерный анализ позволил выделить физико-химические параметры, дающие возможность адекватно идентифицировать качество образца. В качестве маркеров подлинности коньячной продукции выделены этиловый эфир октановой кислоты, концентрация фенольных соединений, антиоксидантная емкость по отношению к катион-радикалу ABTS и интенсивность цвета. Определение дополнительных параметров (рН, антиоксидантная емкость по отношению к пероксильному радикалу, содержание сиреневого альдегида) требуется лишь в случае граничных результатов.
С использованием метода главных компонент визуализирован кластерный анализ и показана его корреляция с органолептическим тестированием.
Таким образом, выбранный набор маркеров может служить показателями качества коньячной продукции.

Список литературы

1. ГОСТ р 51618-2000. Коньяки российские. Общие технические условия. — М.: изд-во стандартов, 2001. 11 с.
2. Gerard, J. M. New Isotopic criteria for shortterm dating of brandies and spirits/J. M. Gerard, N. Lionel, N. Norbert, L. M. Maryvonne//J. Sci Food Agric. 1998. 77 (2). P 153-160.
3. Lehtonen, P. J. Multi-method analysis of matured distilled alcoholic beverages for brand identification/P. J. Lehtonen, L. A. Keller, E. T. Ali- Matilla//Z Lebensm Unters Forsch. 1999. 208. P. 413-417.
4. Picque, D. Discrimination of Cognacs and other distilled drinks by mid-infrared spectropscopy/D. Picque, P. Lieben, G. Corrien, R. Cantagre, O. Lablanquie, G. Snakkers//J Agric Food Chem. 2006. 54 (15). P. 5220-5226.
5. Recuiel des methods internationals d'analyse des boissons spiritueuses des alcools et de la fraction aromatique des boissons Officiel International de la vigne et du vin O. I. V. (1994). Paris.
6. Скурихин, И. М. Химия коньяка и бренди/И. М. Скурихин//М.: дели, 2005. 296 с.
7. Pellegrini, N. Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays/N. Pellegrini, M. Serafini, B. Colombi, D. Rio, S. Salvatore, M. Bianchi & F. Brighenti// The Journal of nutrition. 2003. 133 (9). P. 28122819.
8. Савчук, С. А. идентификация винодельческой продукции методами высокоэффективной хроматографии и спектрометрии/С. А. Савчук, В. Н. Власов//Виноделие и виноградарство. 2000. № 5. С. 5-13.
9. Власов, В. Н. анализ качества бренди из винограда методом хромато-масс-спектрометрии/В. Н. Власов, Д. С. Маруженков//Виноград и вино. 1999. № 1. С. 28-31.
10. Гулиев, Р. Р. определение содержания ароматических альдегидов в выдержанных коньячных спиртах методом газовой хроматографии/Р. Р. Гулиев, Т. А. Начева, С. В. Волкович, И. М. Скурихин//Виноделие и виноградарство. 2001. № 1. С. 17-18.
11. Якуба, Ю. Ф. определение ароматических альдегидов в коньячных спиртах и коньяках/Ю. Ф. Якуба, Н. М. Агеева, Т. И. Гугучкина//Виноделие и виноградарство. 2005. № 3. С. 15.
12. Panossian, A. Analysis of aromatic aldehydes in brandy and wine by high-performance capillary electrophoresis/A. Panossian, G. Mamikonyan, M. Torosyan, E. Gabrielyan, S. Mkhitaryan//J. Anal Chem. 2001. № 73. P. 4379-4383.
13. Оселедцева, И. В. научно-практическая работа как поиск решения биотехнологических и экономических проблем при производстве натуральных вин и коньяков/и. В. Оселедцева, А. Н. Микелов, Э. М. Соболев, К. А. Бабаян — Материалы [1-й] науч.-практ. конф., 14 нояб. 2001 г. Ставроп. ин-т им. В. Д. Чурсина. изд-во Ставроп. ин-та им. В. д. Чурсина, 2001. С. 25-28.
14. Gimenez, R. Determination of gallic acid in commercial brandies using hugh performance liquid chromatorgaphy/R. Gimenez, M. Villalon, M. Navarro, C. Cabrera, M. Olalla, J. J. Quesada, M. C. Lopez//Ciencia Tec. Aliment. 2000. № 3 (1). P. 13-20.
15. Ou, B. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe/ B. Ou, M. Hampsch-Woodill & R. L. Prior//Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001. № 49 (10). P. 4619-4626.
16. Huang, D. The chemistry behind antioxidant capacity assay/D. Huang, B. Ou, R. L. Prior//J. Agric. Food chem. 2005. № 53. P. 1841-1856.
17. Re, R. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay/R. Re, N. Pellegrini, A, Proteggente, A. Pannala, M. Yang, C. Rice-Evans//Free radical biology and medicine. 1999. № 26 (9/10) P. 1231-1237.
18. Николаев, И. В. оценка антиоксидантной емкости коньяков/и. В. Николаев, О. В. Королева, Е. В. Степанова, Б. Ц. Зайчик//Виноделие и виноградарство. 2009. № 2. С. 13-15.
19. Singleton, V. L. Colorimetry of total phenolics with phospohmolibdic-phosphotungstic acid reagents/V. L. Singleton, J. Rossi//Am. J. Enology and viticulture. 1965. № 16. P. 144-158.
20. Зайчик, Б. Ц. Методы оценки подлинности коньяков. Сравнительные исследования их индивидуального состава/Б. Ц. Зайчик, А. О. Ружицкий, В. П. Хотченков, С. С. Щербаков, О. В. Королева//Виноделие и виноградарство. 2007. № 6. С. 12-13.
21. Savchuk, A. M. Chromatographic Techniques in the Quality Control of Cognacs and Cognac Spirits/A. M. Savchuk, G. M. Kolesov//Journal of ananytical chemistry. 2005. № 60 (8). P. 752-771.
22. Черняга, Б. С. Комплекс хроматографических методов контроля качества винодельческой продукции/Б. С. Черняга, И. Ш. Шатиришвили, Ш. И. Шатиришвили, К. И. Бериашвили//Технология переработки сельскохозяйственных продуктов. 2006. № 4 (1). С. 120-127.
23. Гулиев, Р. Р. Международный метод определения цветности вин применительно к коньякам/Р. Р. Гулиев, Т. А. Начева, С. С. Дергачева, Л. В. Беркетова, И. М. Скурихин//Виноделие и виноградарство. 2002. № 3. С. 20-21.
24. Валуйко, Г. Г. Теория и практика дегустации вин/Г. Г. Валуйко, Е. П. Шольц-Куликов//Симферополь: Таврида, 2005. 232 с.
25. Pelligrini N. Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays/N. Pelligrini, M. Serafini, B. Colombi, D. Rio, S. Salvatore, M. Bianchi, F. Brighenti//The journal of nutrition. 2006. № 3. P. 2812-2818.
26. Gomez-Cordoves, C. Application of principal component analysis to simple determinations of brandies as a means of verifying quality/C. Gomez-Cordoves, B. Bartolome//Z Lebensm Unters Forsch. 1993. № 197. P. 260-263.