В настоящее время механизм процесса яблочно-этанольного брожения изучен недостаточно. Дальнейшее исследование биохимических и микробиологических сторон этого процесса позволит разрешить трудности, которые возникают при проведении в условиях производства биологического кислотопонижения в виноградном сусле и вине.
Об особенностях брожения виноградного сусла дрожжами-кислотопонижателями в литературе встречаются лишь разрозненные сведения. Так, Кюнке и Америн (1970) сообщают, что сбраживание сахаров дрожжами-кислотопонижателями происходит в два раза медленнее, чем винными дрожжами. Пейно и Сюдро (1964), Видан (1979) считают, что разложение яблочной кислоты проходит только в присутствии сахаров. В литературе встречаются утверждения, что в процессе метаболизма содержанию лимонной кислоты не изменяется (Сахарова, Коссобудская, Тарасенко, 1974).
Нами были изучены впервые (Таина, Иванова, Белова, 1981) особенности сбраживания виноградного сусла дрожжами-кислотопонижателями на примере рас «Кодру» и «Виерул», а также влияние ряда важных технологических компонентов сока на качество полученных молодых виноматериалов.
Taблица 40
Бродильная способность дрожжей на сусле с различной сахаристостью
Прежде всего это касается влияния исходной сахаристости и кислотности сусла на энергию брожения и эффект кислотопонижения, роли остаточного сахара в процессе яблочно-этанольного брожения, а также субстратной специфичности дрожжей-кислотопонижателей по отношению к ряду химических компонентов виноградного сока. Определение способности дрожжей сбраживать те или иные субстраты осуществляли классическим методом — ио определению количества выделившейся углекислоты. Это дало возможность сравнить энергию брожения дрожжей двух родов — сахаромицетов и шизосахаромицетов, а также определить особенности представителей этих родов по отношению к составу среды и их относительную конкурентабельность.
Результаты сравнения бродильной способности винных дрожжей (контроль) и дрожжей-кислотопонижателей (штамм 99) на сусле с различной концентрацией сахаров представлены в таблице 40 и на рис. 19.
Данные таблицы 40 указывают на отставание количества выделившегося СО2 при сбраживании сусла дрожжами-кислотопонижателями по сравнению с винными дрожжами. Эта закономерность не связана с исходной сахаристостью сусла, однако данные общей потери СО2 за 21 день опыта показали, что при сахаристости сусла 14,8% количество выделившегося СО2 практически одинаковое в обоих вариантах опыта; при сахаристости 18,8% раса «Кодру» дала увеличение количества выделившегося СО2 (0,7 г). В варианте с концентрацией сахаров в сусле 27,6% общая потеря СО2 у дрожжей-кислотопонижателей существенна и соответственно на 2,7 г выше по сравнению с винными дрожжами. Эту разницу увеличения выделившегося СО2 при сбраживании сусла расой «Кодру» в сравнении с Кишиневской 341 можно объяснить, очевидно, дополнительным выделением СО2 как результата разложения яблочной кислоты и соответственно снижением общей титруемой кислотности сусла.
Кривые бродильной способности дрожжей сахаромицетов и шизосахаромицетов (рис. 19) подтверждают сведения, имеющиеся в литературе о том, что бродильная активность винных дрожжей в два раза выше. Они заканчивают брожение (остаточный сахар 0,1—0,3%) на 10—11-е сутки, тогда как дрожжи-кислотопонижатели (по выделению СО2) — на 21-е сутки.
На основании полученных результатов можно предположить, что активность дрожжей-кислотопонижателей не зависит от исходной сахаристости сусла. На значение этого показателя, вероятно, большее влияние оказывает содержание яблочной кислоты.
Исследование динамики изменения основных компонентов сусла при брожении на винных, кислотопонижающих дрожжах и их смеси (в соотношении 1:1) проводили при температурах 16, 20, 28°С с ежедневным определением титруемой кислотности, спирта и остаточного сахара. Выяснилось, что температура брожения в данном случае не оказывает существенного влияния на ход процесса.
Рис. 20. Изменение основных компонентов сусла при сбраживании его винными, кислотопонижающими дрожжами и их смесью.
Изменение основных компонентов сусла при брожении во всех вариантах носило однотипный характер. Процесс снижения концентрации сахаров и увеличения спирта у кислотопонижающих дрожжей отстает незначительно от изменения этих компонентов у винных дрожжей. Существенно различны с первых дней брожения изменения показателя общей титруемой кислотности при брожении на различных дрожжах и их смеси.
Таким образом, можно считать, что процесс брожения у дрожжей шизосахаромицетов удлиняется преимущественно за счет разложения яблочной кислоты, а не за счет сбраживания сахаров среды.
Данные опыта со смесью дрожжей подтвердили имеющееся в литературе мнение о том, что при наличии в среде смеси активных клеток винных дрожжей и дрожжей-кислотопонижателей (1:1) яблочно-этанольное брожение одновременно со спиртовым практически не проходит и соответственно показатель титруемой кислотности практически не изменяется (рис. 20).
Сбраживающая способность дрожжей-кислотопонижателей на сусле и различных его компонентах
Особенности брожения шизосахаромицетов на виноградном сусле и на модельных растворах изучали определением бродильной активности расы «Кодру» на средах: виноградном сусле с сахаристостью 15,1%, титруемой кислотностью 9,4 г/л (1); модельном растворе, состоящем из водного раствора органических кислот (винной —3 г/л, лимонной — 1 г/л, яблочной —6 г/л) и глюкозы 16% (2); водном растворе яблочной кислоты — 6 г/л (3); водном растворе яблочной кислоты —6 г/л и глюкозы 16% (4); водном растворе лимонной кислоты 1 г/л (5); водном растворе лимонной кислоты 1 г/л и глюкозы 16% (6); водном растворе глюкозы 16% (7).
В вышеназванные стерильные среды вносилась разводка дрожжей-кислотопонижателей расы «Кодру» в активном состоянии и выращенная на водном растворе сахарозы (210 млн. клеток в 1 мл) в количестве 5%, при этом задаваемая разводка чистой культуры указанных дрожжей практически не содержала сахара (0,1%); колбы закрывались затворами Мейсля. Брожение проходило при оптимальной температуре (26—27°С) в течение 21 дня.
По завершении опыта определяли энергию брожения (по количеству выделившегося газа), титруемую кислотность, pH, концентрацию спирта и органические кислоты методом бумажной хроматографии.
По количеству выделившейся углекислоты за сутки, двое, трое и т. д. до 21 суток построены кривые брожения, представленные на рис. 21, а также обработаны данные анализов изменения титруемой кислотности, pH и органических кислот, определена сумма выделившегося СО2 за 21 день наблюдения (табл. 41).
Кривые брожения показывают, что наибольшая бродильная способность у дрожжей шизосахаромицетов при сбраживании виноградного сусла, наименьшая — при сбраживании раствора яблочной и лимонной кислот.
Способность изученных дрожжей шизосахаромицетов (расы «Кодру») и выделенной позже расы «Виерул» сбраживать лимонную кислоту установлена нами впервые. Общее количество выделившейся углекислоты при деградации лимонной кислоты незначительно; выделение ее прекращалось на 14-й день брожения.
Бродильная способность дрожжей-кислотопонижателей на растворе яблочной кислоты несколько выше. В этом варианте выделение СО2 также прекращается на 14-й день.
Значительное повышение бродильной способности дрожжей шизосахаромицетов наблюдается при сбраживании растворов указанных кислот с глюкозой. В этих условиях энергия брожения находится на уровне вариантов сбраживания раствора глюкозы и раствора, моделирующего виноградное сусло.
Рис. 21. Бродильная способность дрожжей шизосахаромицетов при сбраживании различных сред (расшифровка вариантов опыта приведена в таблице 41).
Данные таблицы 41 и рисунка 21 подтверждают сделанный нами вывод об отсутствии связи между бродильной способностью и кислотопонижающей активностью у дрожжей шизосахаромицетов. Наибольший эффект кислотопонижения наблюдался при сбраживании водного раствора яблочной кислоты (вариант 3). При сбраживании яблочной кислоты с глюкозой (вариант 4) эффект кислотопонижения уменьшался примерло в 2 раза, тогда как бродильная способность увеличивалась примерно в 12 раз.
В варианте 7 при сбраживании раствора глюкозы происходит увеличение показателя титруемой кислотности на величину 1,8 г/л; на хроматограммах этого раствора идентифицированы винная и янтарная кислоты. Можно предположить, что уменьшение кислотопонижающей активности в варианте 4—результат суммарного эффекта от сбраживания яблочной кислоты и глюкозы.
Полученные данные этого опыта свидетельствуют не только о возможности, но и о большом кислотопонижающем эффекте в средах, не содержащих сахаров. Это явление натолкнуло нас на мысль о применении расы «Виерул» для раскисления вин. В подтверждение вышесказанного нами было успешно проведено раскисление столовых белых и красных вин.
Необходимо обратить внимание на факт повышения общей кислотности при сбраживании дрожжами шизосахаромицетов раствора лимонной кислоты (вариант 5, табл. 41). При сбраживании лимонной кислоты с глюкозой показатель общей кислотности увеличивается в 5 раз (вариант 6), при этом в среде обнаруживаются значительные количества винной кислоты. Аналогичные результаты были получены неоднократно и характеризуются высокой степенью воспроизводимости.
Качественное определение органических кислот методом бумажной хроматографии свидетельствует о полном разложении яблочной кислоты только в варианте 3. При сбраживании водного раствора лимонной кислоты (вариант 5) установлено, что се разложение происходит не полностью. Представляет особый интерес появление на хроматограммах винной кислоты в средах, сброженных с лимонной и яблочной кислотами как в присутствии, так и в отсутствии глюкозы.
Очевидно, появлением винной кислоты в сброженных модельных средах можно объяснить наблюдающееся повышение титруемой кислотности в вариантах 5, 6 и 7. Это соответствует (табл. 41) изменению значений pH. Появление янтарной кислоты в сброженных средах согласуется с литературными данными Б. К. Ранкина (1966).
В дополнение можно отмстить, что в модельных опытах по сбраживанию пентоз (водный 1%-ный раствор арабинозы и водный 0,5%-ный раствор ксилозы), а также маннозы было установлено аналогичное явление. По завершении опыта наблюдалось повышение, титруемой кислотности среды на 0,7—1,0 г/л, а идентификация органических кислот методом бумажной хроматографии показала присутствие винной и янтарной кислот, которые вызвали повышение титруемой кислотности среды, как и в вариантах при сбраживании совместно глюкозы с лимонной кислотой (табл. 41).
Способность дрожжей-кислого понижателей сбраживать частично лимонную кислоту и гексозы и образовывать при этом соответственно винную и янтарную кислоты можно усматривать как особенность метаболизма π представляет как теоретическое, так и практическое значение.
Выше нами было показано, что активность дрожжей шизосахаромицетов нс зависит от сахаристости сусла и что наибольший эффект снижения общей кислотности достигается при сбраживании чистого раствора яблочной кислоты.
Для исследования зависимости технологического эффекта кислотопонижения от содержания в сусле яблочной кислоты был проведен опыт на стерильном виноградном сусле (титруемая кислотность 7,7 г/л, сахаристость 14,0%) с добавлением яблочной кислоты от 1 дο 6 г/л.
Во всех вариантах определяли исходную титруемую кислотность и pH. Сусло сбраживалось дрожжами шизосахаромицетов (штамм 99). Изменение кислотности при брожении регистрировалось в динамике. Полученные данные представлены на рисунке 22.
Результаты этого опыта позволяют сделать вывод о том, что технологический эффект кислотопонижения зависит от содержания яблочной кислоты в сусле и увеличивается с повышением ее концентрации.
Обращает на себя внимание тот факт, что наиболее активно процесс биологического кислотопонижения идет в первые три дня брожения, затем наступает период (на 7—8-й день), когда происходит выравнивание кислотности во всех вариантах опыта независимо от первоначального содержания яблочной кислоты в сусле. При этом уровень показателя титруемой кислотности (5—7 г/л) остается неизменным на протяжении 30 дней наблюдения.
Свойство ферментативной системы дрожжей-кислотопонижателей разлагать субстрат (яблочную кислоту сока) при высоких его концентрациях (10 г/л или при титруемой кислотности 13-15 г/л) открывает большие технологические возможности применения в виноделии этого вида микроорганизмов. В отличие от бактерий яблочно-молочного брожения, ферментативный комплекс которого ингибируется компонентами сусла уже при титруемой кислотности 10 г/л и выше, дрожжи шизосахаромицетов могут успешно проводить разложение яблочной кислоты практически при любых значениях исходной кислотности виноградного сусла.
Азотистый обмен, наряду с углеводным, является главным в процессе брожения. Основную часть азотистых веществ сусла и вина (50% и более общего содержания азота) составляют аминокислоты. Их состав меняется не только в зависимости от сорта винограда, агротехники и климатических условий, но и от применяемой технологии виноделия, в частности от вида дрожжей, сбраживающих сусло. В процессе своей жизнедеятельности дрожжи, с одной стороны, потребляют азотистые вещества, с другой — выделяют их в сусло и вино, особенно в результате автолиза клеток.
Нами было проведено сравнительное определение состава аминокислот в виноматериале, полученном при брожении сусла винными дрожжами (раса Кишиневская 341) и дрожжами-кислотопонижателями (расами «Кодру» и «Виерул»), При сбраживании виноградного сусла сорта Совиньон с кондициями 18,0% сахаров и 10,3 г/л титруемых кислот был получен виноматериал столовый с титруемой кислотностью соответственно 7,3 и 6,4 г/л.
Состав аминокислот в виноматериале определялся на аминокислотном анализаторе. Были идентифицированы и количественно определены 18 аминокислот.
Анализируя полученные данные, можно сказать, что 7 аминокислот из 18 в виноматериалах, полученных в результате яблочно-этанольного брожения, находятся в меньшем количестве, чем в виноматериале, полученном в результате этанольного брожения. Это следующие аминокислоты; аспарагиновая (в 2 раза), серин (в 1,5 2 раза), глутаминовая (в 2—3 раза), иролин (незначительно), аланин (около 10 раз), валин (в 2,5-3 раза) и лейцин (в 2—3 раза). 6 аминокислот находятся приблизительно в одинаковом количестве. Это - аргинин, метионин, изолейцин, тирозин, фенилаланин и α-амино- масляная кислота.
В большем количестве обнаружены лизин (в 2 раза), гистидин (в 1,5 раза), треонин (в 2—4 раза) и глицин (в 1,5—2 раза), а 2 аминокислоты — цистин и метионин — в следовых количествах.
Таким образом, имеются значительные различия в аминокислотном составе виноматериалов, сброженных на винных и кислотопонижающих дрожжах.
Суммируя полученные результаты, можно отметить следующие особенности сбраживания виноградного сусла и ряда его компонентов дрожжами шизосахаромицетов рас «Кодру» и «Виерул».
- Кислотопонижающая активность дрожжей-кислотопонижателей не зависит от сахаристости сусла.
- Изменение концентрации сахаров и спирта при брожении сусла идет однотипно (с незначительным отставанием во времени снижения сахаров и повышения спирта у шизосахаромицетов по сравнению с сахаромицетами), и процесс брожения удлиняется преимущественно за счет разложения яблочной кислоты.
- Эффект кислотопонижения находится в прямой зависимости от содержания яблочной кислоты в сусле.
- Впервые нами установлен факт частичного сбраживания дрожжами шизосахаромицетов рас «Кодру» и «Виерул» лимонной кислоты с образованием в среде винной кислоты и сбраживания лимонной кислоты с глюкозой, чистой глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннозы с образованием винной и янтарной кислот.
- Состав аминокислот виноматериалов после проведения яблочно-этанольного брожения существенно отличается от аминокислотного состава вин, полученных путем этанольного брожения.
